Работа №4. Определение группы крови
Способ 1.Определение группы крови поликлональными иммунными моноспецифическими сыворотками.
Определяют группу крови методом иммунных антител. Набор сывороток-реагентов получают путем иммунизаций. Моноспецифическая сыворотка содержит иммунные антитела к одному какому-либо кровяному фактору группы крови.
Группы крови в течение всей жизни не меняются, определяются 1 раз и заносятся в карточку племенного животного.
В настоящее время у КРС обнаружены 100 факторов крови, у кур и свиней - по 60, у лошадей и овец - более 20.
Материал и оборудование: Скарификатор, спирт, вата, предметные стекла, стандартная сыворотка (I, II, III, IV групп), глазные пипетки (4 штуки), карандаш по стеклу, физиологический раствор.
Ход работы.Из только что полученной капли крови стеклянными палочками или уголками предметного стекла переносят небольшое количество крови в стандартные сыворотки (сыворотки по одной капле, заранее наносятся на предметное стекло или тарелку с подписанными номерами групп крови соответствующих сывороток) и содержимое перемешивают (обязательно теми же палочками или уголками предметного стекла). Соотношение объёмов сыворотки и крови должно быть около 10:1. По истечении 5-10 минут, покачивая предметное стекло (или тарелку), по агглютинации эритроцитов определяют группу крови. Агглютинация эритроцитов хорошо видна невооруженным глазом (имеет вид песка или комочков с зонами просветления).
Если агглютинация отсутствует во всех каплях, то испытуемая кровь принадлежит к I группе. Если же агглютинация произошла в сыворотке I и II группы и не произошла в сыворотке III - кровь III группы. Если агглютинация произошла в сыворотке I и III группы и не произошла во II - II группы. В случае агглютинации в трех сыворотках - кровь IV группы. В сыворотке IV группы агглютинация не происходит (контроль на отсутствие агглютинации).
Если в сыворотку добавлено большое количество крови - возможно образование сгустков затрудняющих выявление агглютинации. В этих случаях работу надо повторить или же добавить в смесь сыворотки и крови несколько капель физиологического раствора. Это же делают в тех случаях, когда агглютинация нечеткая.
Учитывая важность определения групп крови данное исследование должно выполняться с двумя комплектами сывороток из разных серий. А результат считается правильным, если данные, полученные с разными сериями сывороток, совпадут.
Записать результаты и сделать выводы.
Способ 2.Определение группы крови с помощью моноклональных антител (ЦОЛИКЛОНОВ Анти-А, Анти-В и Анти-АВ).
ЦОЛИКЛОНЫ Анти-А, Анти-В и Анти-АВ предназначены для определения (на плоскости: пластине или планшете) групп крови системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.
Моноклональные Анти-А и Анти-В антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса М. ЦОЛИКЛОНЫ (изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом). ЦОЛИКЛОН Анти-АБ является смесью моноклональных анти-А и анти-В антител.
Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при комнатной температуре (15-25 °С). ЦОЛИКЛОНЫ выпускаются в жидкой форме(флаконы по 10 мл). Жидкость с Анти-А красного цвета, Анти-В - синяя и Анти-АВ - бесцветная.
Материал и оборудование: Скарификатор, спирт, вата, предметные стекла, комплект ЦОЛИКЛОНОВ с пипетками (или капельницами), карандаш по стеклу.
Ход работы.
Нанесите под соответствующими надписями на планшет или пластину индивидуальными пипетками ЦОЛИКЛОНЫ Анти-А, Анти-В и Анти-АВ по одной капле (около 0,1 мл).
Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (объём 0,01-0,03 мл).
Смешайте кровь с реагентом.
Наблюдайте за ходом реакции с ЦОЛИКЛОНАМИ визуально при легком покачивании пластины или планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с ЦОЛИКЛОНАМИ обычно наступает в первые 3-5 сек, но наблюдение следует вести 3 мин ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинация видна невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты не обнаруживаются.
Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с ЦОЛИКЛОНАМИ представлена в таблице.
| Результат реакции* с ЦОЛИКЛОНОМ: | Исследуемая кровь принадлежит к группе** | ||
| Анти-А | Анти-В | Анти-АВ | |
| - | - | - | 0(I) |
| + | - | + | А(II) |
| - | + | + | В(III) |
| + | + | + | АВ(IV) |
* Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие агглютинации
** Окончательно АВО принадлежность устанавливается по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на эритроцитах и изогемагглютининов а сыворотке.
При наличии агглютинации со всеми тремя ЦОЛИКЛОНАМИ необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого необходимо смешать на плоскости 1 каплю исследуемой крови с каплей физиологического раствора.
Кровь можно отнести к группе АВ (IV) только если и в физиологическом растворе (без ЦОЛИКЛОНОВ) агглютинации эритроцитов нет.
Записать результаты и сделать выводы.
Вопросы для самоконтроля знаний.
1. Что такое система крови?
2. Какие функции выполняет кровь?
3. Что такое кровь, тканевая жидкость и лимфа? Как они образуются? Подробно опишите их функции.
4. Дайте подробную функциональную характеристику всем компонентам плазмы крови.
5. Что такое гомеостаз? Раскажите это с соответствующим обоснованием на примере крови (рН, осмотическое и онкотическое давление и др.).
6. Буферные системы крови и их значение для поддержания гомеостаза.
7. Опишите образование, строение, продолжительность жизни и функции эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.
8. Опишите роль в процессе кроветворения витаминов, кобальта, железа, меди и эритропоэтинов.
9. Что такое группа и система групп крови? Для чего их определяют?
10. Сколько антигенов и систем групп крови установлено у сельскохозяйственных животных?
11. В чем заключаются физиологические функции эритроцитов?
12. В чем заключаются физиологические функции разных видов лейкоцитов?
13. Каков механизм свертывания крови?
14. Что такое свертывающая системы крови и каковы функции ее элементов?
15. Что такое противосвертывающая системы крови и каковы функции ее элементов?
16. Что такое гемоглобин и миоглобин. Какие функции они выполняют?
17. Как осуществляются связывание и транспорт газов (О2 и СО2) кровью?
18. Как образуются карбоксигемоглобин, карбогемоглобин и метгемоглобин? В чем их функциональные различия?
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ТЕРМИНОВ
Агглютинация - склеивание эритроцитов.
Агрегация тромбоцитов - обратимое образование тромбоцитарной массы.
Адгезивность тромбоцитов - способность тромбоцитов необратимо приклеиваться к чужеродной поверхности, друг к другу, к сосудистой стенке.
Адгезия тромбоцитов - склеивание (необратимое) тромбоцитов.
Алкалоз - сдвиг КЩР в щелочную сторону.
Анемия - состояние, характеризующееся низким содержанием гемоглобина в единице объёма крови.
Анемия гиперхромная - общее название анемий с высоким ЦП и СГЭ.
Анемия гипохромная - общее название анемий с низким ЦП и СГЭ.
Анемия нормохромная - название анемий при нормальных ЦП и СГЭ.
Ацидоз - сдвиг КЩР в кислую сторону.
Белковый коэффициент - отношение количества альбуминов к глобулинам плазмы крови.
Восстановленный Нb (редуцированный Нb) - Нb отдавший кислород.
Гематокрит - объем форменных элементов в крови.
Гемокоагуляция - свертывание крови.
Гемолиз - разрушение эритроцитов и выход из них гемоглобина.
Гемолиз биологический - разрушение эритроцитов попавшими в кровь гемолитическими ядами (например, при змеиных укусах, отравлениях грибами, при переливании несовместимой группы крови).
Гемолиз физиологический - гемолиз небольшого количество старых эритроцитов в плазме здорового животного.
Гемопоэз (кроветворение) - процессы размножения, дифференцировки и созревания форменных элементов крови.
Гемостаз - это сложная система приспособительных механизмов, обеспечивающая текучесть крови в сосудах и свертывание её при нарушении их целостности.
Гипоксия - состояние, возникающее при недостаточном снабжении тканей организма кислородом или нарушении его утилизации в процессе биологического окисления.
Гомеостаз - постоянство состава и свойств внутренней среды организма.
Карбогемоглобин - гемоглобин, присоединивший СО2.
Карбоксигемоглобин - соединение гемоглобина с угарным газом.
Коллоидное (онкотическое) давление - создаваемая коллоидами (белками), сила, вызывающая перемещение воды через полупроницаемые мембраны.
Кроветворение (гемопоэз) - процессы размножения, дифференцировки и созревания форменных элементов крови.
Лейкопения - уменьшение содержания лейкоцитов в крови.
Лейкоцитарная формула (лейкограмма) - выраженное в процентах содержание в крови отдельных классов лейкоцитов.
Лейкоцитоз - увеличение содержания лейкоцитов в крови.
Метгемоглобин - Нb неспособный присоединять кислород в результате перехода железа в геме из двухвалентного в трехвалентное состояние.
Механический гемолиз - гемолиз вызванный механическими факторами (при заборе через узкие иглы и грубом перемешивании крови).
Оксигемоглобин - соединение гемоглобина с кислородом.
Онкотическое (коллоидное) давление - создаваемая коллоидами (белками), сила, вызывающая перемещение воды через полупроницаемые мембраны.
Осмотическая резистентность - устойчивость эритроцитов к гипотоническим растворам.
Осмотический гемолиз - гемолиз наступающий при снижении осмотического давления плазмы крови.
Осмотическое давление - это сила, которая вызывает перемещение воды через полупроницаемые мембраны.
Пирогенные вещества - вещества повышающие температуру тела.
Примитивный Нb - Нb зародыша.
Ретракция - сокращение и уплотнение фибринового тромба.
Сыворотка крови - плазма крови без фибриногена.
Термический гемолиз - гемолиз вызванный изменением температуры.
Фетальный Нb - Нb плода.
Фибринолиз - ферментативное растворение фибрина.
Фибринолитическая система крови - плазминоген вместе со своими активаторами и ингибиторами.
Химический гемолиз - гемолиз вызванный контактом крови с химическими веществами.
Цветовой показатель крови - индекс, отражающий отношение уровня гемоглобина к количеству эритроцитов в 1 мкл крови.
Ширина резистентности эритроцитов - границы концентрации, при которых начинается и заканчивается гемолиз.
Щелочной резерв крови - это сумма всех щелочных веществ в крови (в основном бикарбонатов).