Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски (продолжение).

План занятия:

1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля - Нильсена.

2. Выявление спор у бактерий. Окраска по Ожешко.

3. Выявление капсул у бактерий. Окраска по Бурри-Гинсу.

4. Выявление включений по методу Нейссера.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

1. Кислотоустойчивые бактерии обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, щелочам и спиртам, что связано с наличием в теле микроба нейтральных жиров, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для выявления кислотоустойчивых бактерий применяют концентрированные красители, приготовленные в растворе карболовой кислоты, и подогревание. Карболовая кислота при подогревании разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства. При последующем воздействии серной или азотной кислотой тело микробной клетки не обесцвечивается, что дает возможность отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от бактерий, не обладающих этим свойством. К патогенным кислотоустойчивым бактериям относятся палочки туберкулеза и проказы. К непатогенным - палочка смегмы, нередко находящаяся в моче человека, а также микробы, встречающиеся в организме холоднокровных, на различных злаках, в почве, навозе, молоке, масле. В отличие от туберкулезных бактерий они обесцвечиваются спиртом. Окраска кислотоустойчивых микробов производится по методу Циля - Нильсена.

2. Споры у бактерий образуются при неблагоприятных условиях существования микроба. По расположению споры могут находиться в центре микробной клетки, например у сибиреязвенной палочки, ближе к концу; субтерминально - у Cl.perfringens; и на конце (терминально) - у палочки столбняка. Спорообразование наблюдается среди некоторых палочковидных бактерий и актиномицет. Образование спор происходит в присутствии кислорода и при температуре не ниже 15° и не выше 43°. Споры очень устойчивы к температуре, погибают при кипячении в течение 2-6 часов, при стерилизации в автоклаве (при температуре 120°) погибают в течение 16-30 минут. Споры у бактерий служат для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды.

Бактериальные споры могут быть выявлены с использованиемкакпростых, так и сложных методов окраски. Простой метод: микроорганизм, например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина, окрашивается в зеленый цвет, споры при этом бесцветные, а фон - черный. Наиболее часто применяют сложные методы окрашивания эндоспор по Ожешко и по Шефферу - Фултону.

3. Капсула располагается поверх клеточной стенки и представляет ослизненную клеточную оболочку. Патогенные бактерии образуют капсулу только находясь в организме животных или человека, а при культивировании может появляться при добавлении к питательной среде нативного белка. Капсула защищает их от действия фагоцитов и антител. "Капсульные" бактерии образуют капсулу и в организме, и на питательных средах, где они дают характерный слизистый рост. Для обнаружения капсул у бактерий применяют специальные методы окраски. Чаще всего используется метод Гинса.

4. В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигментные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило названиеметхромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами - запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировав­шие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки - желтого.

Цель занятия

1. Освоить методы микроскопического выявления структурных элементов клетки (споры, капсулы, включения, оболочка кислотоустойчивых бактерий).

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Структурные элементы бактериальной клетки, их назначение и роль в распознавании микробов.

2. Методы микроскопического изученияструктурных элементов бактериальной клетки:

- оболочка кислотоустойчивых бактерий (окраска по Цилю - Нильсену)

-споры (окраска по Ожешко);

-зерна волютина (окраска по Нейссеру);

- капсулы (окраска по Бурри и по Бури - Гинсу).

Уметь:

1. Окрашивать препараты сложными методами в целях выявления кислотоустойчивых бактерий, спор, зерен волютина у дифтерийной палочки, капсул у бактерий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Для выявления туберкулезных бактерийобычно исследуют мокроту. Пинцетом или препаровальными иглами наносят комочек мокроты на середину предметного стекла, затем его покрывают вторым пролетным стеклом, так чтобы одна треть нижнего и одна треть верхнего стекла были свободными. Затем берут за свободные концы стекла и растирают комочек между ними, после чего раздвигают оба стекла. Таким образом, получаются два мазка, которые затем высушивают на воздухе и фиксируют на пламени.

На фиксированный мазок мокроты, для окраски туберкулезных бактерий по Цилю - Нильсену, кладут листок фильтровальной бумаги размером меньше предметного стекла и наливают на него карболовый фуксин Циля. Окрашиваемый мазок подогревают на пламени до появления пара, который хорошо заметен, если смотреть на препарат сбоку, так его подогревают 2-3 раза.

Препарату дают остыть, сбрасывают бумажку с краской и наносят 5% серную или 25% азотную кислоту до появления желтого окрашивания, после чего быстро и тщательно промывают водой.

Докрашивают препарат метиленовой синькой в течение 4 -6 мин, после чего промывают водой, высушивают и рассматривают под иммерсионной системой.

Туберкулезные палочки окрашиваются в рубиново - красный цвет, а форменные элементы, некислотоустойчивые бактерии в синий цвет.

Для окрашивания спор по методу Ожешко готовят густой мазок на одном конце предметного стекла и высушивают на воздухе, после чего на него наносят 1% раствор соляной кислоты и нагревают на пламени до появления паров в течение 1-2 минут. Препарат промывают водой, высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циля - Нильсена. При иммерсионной микроскопии обнаруживают красного цвета споры и синего цвета вегетативные тела.

Метод Шеффера - Фултона: фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 - 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров. Сняв фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и в течение 30 сек. докрашивают 0,5 % раствором сафранина и вновь промывают водой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка - в красный.

Для выявления капсул по методу Гинса на предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок, как мазок крови: ребром одного стекла проводят по поверхности другого. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Для выявления зерен волютина на фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 мин. Сняв бумагу, промывают мазок водой. Наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. Промывают водой, докрашивают мазок водным раствором этиленового синего в течение 3-5 мин., вновь промыв водой, высушивают и микроскопируют

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Приготовление препаратов из нативной мокроты иих окраска по Цилю-Нильсену.

2. Окрашенные препараты, приготовленные из мокроты туберкулез­ных больных и из чистой культуры дифтерийной палочки.

3. Споры антракоида, окрашенные по методу Шефера-Фултона.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Приготовить препарат из культуры Corynebacterium, окрасить по Цилю-Нильсену, микроскопировать и зарисовывать.

2. Приготовить препарат из Кl.pneumoniae или К1.ozaenae методом Бурри-Гинса, микроскопировать и зарисовать их.

3. Микроскопировать окрашенные по Ожешко препараты спор антра­коида и зарисовать их.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие палочковидные формы принято называть бациллами?

2. В каких условиях образуется капсула у бактерий?

3. В каких условиях образуется спора у бактерий?

4. Каково назначение капсулы у бактерий?

5. Каково назначение споры у бактерий?

6. Какие химические вещества входят в состав капсулы?

7. Как обнаружить капсулу у бактерий?

8. Каким преимущественно формам бактерий присуще спорообразование?

9. Как можно убить спору?

10. Чем обусловлена кислотоустойчивость спор?

11. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии по методу Циля-Нильсена?

12. Чем обусловлена кислотоустойчивость бактерий?

13. Каково назначение зерен волютина?

14. Как можно выявить зерна волютина?

15. Что такое метахромазия?

16. Какое значение имеетобнаружение зерен волютина у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №4

Тема:

• Морфология спирохет, грибов, риккетсий, хламидий, простейших, вирусов (бактериофагов).

План занятия:

1. Особенности морфологии спирохет.

2. Изучение морфологии нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфология облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий и хламидий).

4. Изучение морфологии простейших.

5. Морфология вирусов. Бактериофаги: строение бактериофагов, по­лучение бактериофагов, титрование. Применение в медицине.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Спирохеты (трепонемы, боррелии, лептоспиры). Бледная трепонема вызывает сифилис, боррелии - возвратный тиф и клещевой боррелиоз (болезнь Лайма), лептоспиры - желтушный лептоспироз.

Оболочка спирохет тонкая, эластичная, содержит большое количество липопротеидов и тонкий не сплошной слой пептидогликана. Обычными методами трепонемы не окрашиваются, так как при фиксации спиртом оболочка легко разрушается и клетка не в состоянии удерживать красители. Спирохеты также, как и простейшие, плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Для их дифференцирования применяют краску Романовского-Гимзы или микроскопируют нативные препараты в темном поле или в фазово - контрастном микроскопе (при сифилисе, лептоспирозе).

Грибы представляют собой растительные организмы, лишенные хлорофилла. В отличие от бактерий, клетки грибов имеют дифференцированное ядро и размножаются бесполым и половым способом. По особенности строения мицелия и образования половых спор грибы делят на несколько классов.

Представители класса фикомицетов имеют несептированный мицелий и относятся к низшим грибам (мукоровая плесень). Мукоровые грибы представляют собой сильно разветвленную клетку, от которой отходят плодоносящие гифы - спорангеносцы с шароподобными образованиями наверху - спорангиями, наполненными эндоспорами. К классу аскомицет относятся аспергиллус и пенициллиум. Аспергилус имеет расчлененный мицелий, одноклеточный конидиеносец, на головке которого веерообразно расположены короткие стеригмы, от которых отшнуровываются экзоспоры (при микроскопии напоминают струйки вытекающей из лейки воды). У пенициллиума и конидиеносцев многоклеточных, плодоносящее тело имеет вид кисточки. Представители этих двух классов грибов широко распространены в природе и, как правило, ведут сапрофитический образ жизни. В отдельных случаях могут вызывать поражение дыхательных путей, среднего уха, глаз.

Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 микронов. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная. Наружных спор (типа конидий), и внутренних (типа аскоспор), дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10 -20 микронов, форма округлая, оболочка толстая, двухконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называют псевдомицелием и отличаются они от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования. В патологии человека определенную роль играют дрожжеподобные грибы из рода Candida, поражающие чаще всего слизистую желудочно-кишечного тракта.

Лучистые грибки - актиномицеты - по строению совмещают свойства бактерий и грибов. В патологии человека встречаются актиномицеты, вызывающие актиномикоз - заболевание, характеризующееся образованием лучистых друз в гнойно-воспалительных инфильтратах различных тканей. Представители семейства Streptomycetaceae служат источником для получения антибиотиков.

Риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Это мельчайшие грамотрицательные микроорганизмы кокковидной или палочковидной формы, неспособные расти на искусственных питательных средах. Они могут развиваться только в живой клетке с пониженным метаболизмом. Их культивируют в желточном мешке куриного эмбриона. Клетка содержит клеточную стенку, ЦПМ, цитоплазму, нуклеоид и рибосомы, что сближает их с бактериями. Внутриклеточное размножение и абсолютный паразитизм сближает их с вирусами. По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе.

По П. Ф. Здродовскому, наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсий): 1) кокковидные (0,5мкм), 2) палочковидные (короткие -1-1,5мкм), 3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3 – 4 мкм), 4) нитевидные (20 -40мкм). Все формы полиморфны.

Риккетсии окрашивают по Граму (грамотрицательны), по Романовскому - Гимзы и по Здродовскому.

Хламидии - грамотрицательные, мелкие кокковидные бактерии, размножаются только в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, т.е., как и риккетсии, они относятся к числу облигатных внутриклеточных бактерий. Попавшие в чувствительную клетку элементарные тельца хламидий превращаются в ретикулярные тельца, которые делятся пополам. После нескольких делений образуются промежуточные формы, превращающиеся затем в элементарные тела. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз и венерическую болезнь.

Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4 - 6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагроможде­ния чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.

Хламидии окрашивают по Романовскому - Гимзе, они хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии. Чаще всего для их выявления в соскобах клеток применяют метод иммунной люминесцентной микроскопии.

Простейшие имеют более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами. Снаружи тело простейших покрывает эластичная и ригидная мембрана - пелликула, образованная внешним слоем цитоплазмы. У некоторых видов клеточная мембрана может вклю­чать опорные фибриллы и даже минеральный скелет. Клеточная структу­ра и набор органоидов идентичен клеткам многоклеточных животных орга­низмов. Многие простейшие активно двигаются за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек.

Простейшие включены в царство Protoza, подцарство Animalia, разделенное на 7 типов. Виды, патогенные для человека, например, малярийные плазмодии, лямблии, трихомонады, токсоплазмы, саркоцисты, изоспоры|, пнемоцисты, криптоспоридии, трипаносомы и др. входят в состав3-х типов –Apicomplexa, Sarcomastigophora и Ciliophora. Всего насчитывается около 7 000 видов патогенных для растений, животных и человека. Жизненый цикл паразитических простейших нередко включает образование промежуточных форм в различных хозяевах, что дает им возможность более эффективно инфицировать восприимчивые организмы.

Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и значительно зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации.

Морфология простейших изучается как в живом их состоянии, так и в окрашенном виде. Простая окраска (фуксином или метиленовой синей) непригодна, так как она не позволяет выявить сложную структуру этих микроорганизмов. Наиболее простым способом, дифференцирующим отдельные элементы клетки, является метод окраски по Романовскому - Гимзе. При этом фиксация мазков должна производиться не на пламени, а в каком-либо фиксаторе (например, смесью спирта с эфиром по Никифорову). При выявлении подвижности лучшие результаты достигаются, при применении подогрева предметного столика и исследовании в первые 30 минут после взятия материала.

Вирусы - автономные, проходящие через бактериальные фильтры генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых клетках животных, растений, бактерий, простейших, грибов.

Вирусная частица - вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой - капсидом. У некоторых вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой. Капсид состоит из субъединиц - капсомеров, имеющих чаще всего симметричное строение. Особенностями вирусов являются: фильтруемость, неспособность размножаться на искусственных питательных средах, отсутствие собственных белоксинтезирующих систем, наличие только одной какой-либо нуклеиновой кислоты, дисъюнктивный (разобщенный) способ размножения.

Вирусы, поражающие бактерии (бактериофаги), имеют сперма-тозоидную форму. Они состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту, и отростка. Некоторые фаги не имеют отростка, или он очень короткий. Проникновение фага в бактериальную клетку может закончить­ся гибелью клетки и выходом фага (продуктивная инфекция-вирулентный фаг). В других случаях геном фага интегрирует с геномом клетки. Клетка не погибает, а геном фага репродуцируется с геномом клетки. Такая культура бактерий называется лизогенной. Лишь в отдельных клетках лизогенных бактерий фаг размножается и вызывает гибель клеток (умеренный фаг). Бактериофаги получают путем фильтрации материала через бактериальные фильтры. Количество бактериофагов можно определить путем серийных разведений с последующим добавлением их к индикаторным бактериям, выращиваемым на жидкой питательной среде (метод Аппельмана) или выращиваемым на плотной среде в чашках (метод Грациа).

Цели занятия:

1. Изучить особенности строения спирохет, хламидий, риккетсий, нит­чатых и дрожжеподобных грибов, простейших, вирусов, в том чис­ле бактериофагов.

2. Познакомиться с лечебно-профилактическими и диагностическими препаратами из бактериофагов.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Морфологию спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир).

2. Морфологию нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфологию простейших (лямблий, трихомонад, токсоплазм, дизентерийной амебы, малярийного плазмодия).

4. Морфологию хламидий, риккетсий и вирусов, в том числе бактериофагов.

5. Получение бактериофагов, титрование, применение в медицине.

Уметь:

1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов в готовых препаратах.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методика окраски спирохет по методу Романовского-Гимзы.

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет.

Для изучения морфологии грибов необходимо на предметное стекло нанести каплю воды, в которую препаровальными иглами вносится и расправляется мицелий грибов; препарат прикрывается покровным стеклом и рассматривается под сухой системой микроскопа. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла-многоклеточный. У мукора органы плодоношения представлены в виде большого спорангиеносца с эндоспорами, у аспергилла конидиеносцы несептированные в виде лейки, у пеницилла - сортированные в виде кисти рук.