Коринебактерий, встречающихся у человека и растущих на КТС

Свойства Вид корине бактерий	Токсигенные свойства	Цистиназа	Уреаза	Разложение	Редукция нитратов	Дополнительные тесты при идентификации коринебактерий
Глюкозы	Сахарозы	Крахмала	Мальтоза	Трегалоза	Гидролиз желатина	Липофильность
C. diphtheriae var. gravis	+/-	+	-	+	-	+	+	+	-	-	-
C. diphtheriae var. mitis	+/-	+	-	+	-	-	+	+	-	-	-
C. diphtheriae var. intermedius	+/-	+	-	+	-	-	+	+	-	-	+
C. diphtheriae var. belfanti	-	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-
C. ulcerans	+/-	+	+	+	-	+	-	+	+	+	-
C. pseudotuberculosis	+/-	+	+	+	В чаще -	-	В чаще -	+	-	-	-
C. pseudodiphtheriticum (C. hofmani)	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	-
C. xerosis	-	-	-	+	+	-	+/-	+	-	-	-

Примечание: В – вариабельные свойства

5. Изучение реакции иммунодиффузии для определения токсигенности дифтерийной культуры (зарисовать)

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических тел (антитоксина) в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым C.diphtheriae, и антитоксином, нанесенным на полоску фильтровальной бумаги, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или “усов”.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре. В агар добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки и разливают по 12–15 мл в стерильные чашки Петри. Полоску фильтровальной бумажки 1,5 х 8 мм пропитывают антитоксической дифтерийной сывороткой, предварительно разведенной изотоническим раствором NaCl до содержания 500 АЕ в 1 мл. Смоченную бумажку накладывают на поверхность уже застывшего агара, после чего чашки подсушивают в течение 30 минут при 37 градусах. На чашке засевают изучаемые культуры по обеим сторонам бумажки в виде бляшек диаметром 0,6–0,7–0,8 см по 5 с каждой стороны на расстоянии 0,7–0,8 и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 бляшек. Из них – 6 бляшек испытуемой культуры, 4 – контрольного штамма. Посевы инкубируют при 37 ° в течение 24–48 часов. Если культуры продуцируют токсин, он диффундирует в агар, где встречается с антитоксином, взаимодействует и образует белые линии преципитата, которые у разных культур соединяются между собой в виде смыкающихся круглых переходов. Если же линии преципитата неспецифические, то у разных культур они перекрещиваются.

Определение токсигенности C.diphtheriae позволяет решить ряд вопросов в области эпидемиологии и диагностики, особенно в отношении культур, выделенных у бактерионосителей.

6. Изучение лабораторного диагноза дифтерии по схеме (зарисовать)

Схема бактериологического исследования

1 день

Посев исследуемого материала на селективную дифференциально-диагностическую или, при необходимости, в транспортную среду. Инкубирование в термостате при 37 °C.

2 день (24 часа)

1. Изучение выросших колоний, при возможности – постановка пробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При использовании транспортной среды необходимо произвести пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

3. При множественном росте, в случае необходимости, можно провести исследования для выдачи предварительного ответа – дополнительные пробы Пизу и Заксе.

3 день (48 часов)

1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 ч) чашек первичного посева визуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.

4. В случае использования транспортной среды ход исследования см., начиная с п.1. второго дня и далее по схеме.

5. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

6. При обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы можно выдать предварительный ответ о выделении дифтерийного микроба.

4 день (72 часа)

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3 день исследования (через 48 ч роста первичного посева). При обнаружении специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Определяют биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 ч инкубации первичного посева).

3. Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

5 день (96 часов)

1. Выдача бактериологического ответа о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта (в случае 48 ч инкубации первичного посева и 48 ч проявления или непроявления специфических линий преципитации в пробе на токсигенность).

Серологическая диагностика.Для оценки состояния противодифтерийного иммунитета проводят определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека методом постановки реакции пассивной гемагглютинации.

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты, сенсибилизированные дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов. РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами – дифтерийным и столбнячным. Несмотря на возможность использования коммерческих наборов, необходимо соблюдать основные требования, предъявляемые при постановке РПГА, чтобы устранить ошибки, некоторые неточности и даже ошибочные сведения, встречающиеся в Инструкциях по применению от производителей.

При проведении реакции необходимо обратить внимание на следующее:

1. Используют полистироловые одноразовые планшеты с лунками только "U"-образной формы (со сферическим дном). Не допускается повторное использование одноразовых планшетов.

2. Испытуемые сыворотки должны быть прогреты и адсорбированы 50% формалинизированными эритроцитами барана.

3. Титрование испытуемых сывороток всегда начинают (1-я лунка) с разведения 1:10.

4. Используют контрольную противодифтерийную сыворотку (СДК) с содержанием противодифтерийных антитоксических антител – 10 МЕ в мл, разводя ее 1:100 (до содержания 0,1 МЕ в мл). Контрольная противостолбнячная сыворотка (ССК) содержит 4 МЕ в мл, разводят 1:40 (до содержания 0,1 МЕ в мл).

5. Перед проведением исследований необходимо провести контроль на специфическую активность диагностикума с СДК.

6. Обязательные отрицательные контроли:

- на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума;

- на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана в испытуемых сыворотках.

7. Испытуемые сыворотки с титром антитоксических противодифтерийных антител менее 1:10 и 1:20 подлежат повторному исследованию.

8. Сбор, а также обработку проб крови для получения сывороток с целью исследования следует проводить в ЛПО в установленном порядке.

Планшеты оставляют на ровной поверхности в течение 2,5–3,5 ч при температуре 20–22 °C. Перемещение планшетов до учета результатов реакции не допускается. В исключительных случаях учет результатов реакции возможен через 18–22 ч.

Учет и интерпретация результатов

Результаты РПГА оценивают визуально - по степени агглютинации эритроцитов:

(++++) – гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки, напоминая по форме перевернутый купол, края которого могут заворачиваться;

(+++) – агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

(++) – агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

(+) – на дне лунки образуется широкое плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

(-) – осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.

За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два креста (++).

Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: то есть повторно провести обработку сыворотки 50% формалинизированными эритроцитами. Это явление встречается крайне редко.

При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума агглютинация на два креста с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1:3200 и не выше 1:12800, что соответствует 5–7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже 1:1280 и не выше 1:5120, что соответствует 5-7 лункам).

Условно-защитным титром, как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител, принимается титр 1:20.

Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1:20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1:5, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки ее вновь разводят 1:5, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.

Количественные показатели содержания антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови, полученные с помощью РПГА (в титрах), не переводят в другие единицы измерения количества антител.

Техника безопасности при постановке РПГА. Все мероприятия по технике безопасности при постановке РПГА проводятся в установленном порядке.

Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления C. diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токсигенных штаммов от "молчащего" гена дифтерийного токсина нетоксигенных токснесущих штаммов C. diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике дифтерии может иметь только вспомогательное значение – поиск нетоксигенных токснесущих штаммов C. diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.

7. Изучение содержания антител к антитоксину в сыворотке крови(заполнить таблицу 19, дать интерпретацию уровня антител, оформить протокол)

8. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения дифтерии (записать в тетрадь схему 4)

Для стабилизации эпидемической обстановки и снижения заболеваемости необходим эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией, который включает ряд мероприятий: раннее выявление заболеваний дифтерией, вакцинацию, наблюдение за иммунологической структурой населения.

Раннее выявление заболевания дифтерией. С этой целью осуществляют активное наблюдение за больными ангиной, у которых проводят однократное бактериологическое обследование.

Наблюдение за иммунологической структурой населения. Невосприимчивость к дифтерии зависит от содержания в крови специфического антитоксина, нейтрализующего токсин. Дифтерия развивается только у тех лиц, у которых нет антитоксина или его концентрация низкая – менее 0,03 АЕ/мл. Относительное количество антитоксина, которое имеется у человека, на день обследования может быть определено несколькими методами.

Таблица 19

Содержание антитоксических антител

Содержание антитоксических антител в сыворотках крови	Интерпретация результатов
0,01 МЕ/мл<	?
0,01 МЕ/м	?
0,01-0,09 МЕ/мл	?
0,1 МЕ/мл	?
1,0 МЕ/мл³	Уровень антитоксина, обеспечивающий стойкую длительную невосприимчивость к дифтерии.

Уровень антитоксина у заболевших для дифференциации дифтерии и ангины другой этиологии определяют методом Иенсена на кроликах или в пробирочных реакциях: РПГА, радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). Кровь исследуют до введения противодифтерийной сыворотки в первые 5–7 дней болезни. Отсутствие антитоксина или низкий титр его в крови свидетельствуют в пользу дифтерии.

Уровень поствакцинального иммунитета оценивают также по количеству антитоксина, который определяют в РПНА, РИФ, ИФА.

Активную иммунизацию против дифтерии проводят детям с 3- месячного возраста вакциной АКДС. Курс вакцинации состоит из трех введений вакцины внутримышечно с интервалом 45 дней. Сокращение интервалов не допускается. Первую ревакцинацию проводят через 1,5-2 года после законченной вакцинации путем однократного введения АКДС-вакцины.

Последующие ревакцинации проводят вакциной путем однократного внутримышечного введения детям в 9 лет, подросткам в 16 лет и взрослым каждые 10 лет. Если дети и подростки получили при травме столбнячный анатоксин, то плановую ревакцинацию против дифтерии проводят АД-анатоксином. Специфическую терапию дифтерии проводят противодифтерийной антитоксической сывороткой, которую вводят в возможно ранние сроки больному внутримышечно в дозе 5000-50000 МЕ в зависимости от тяжести болезни, предварительно определив индивидуальную чувствительность к лошадиному белку. При повышенной чувствительности к лошадиному белку сыворотку применяют по безусловным показаниям в присутствии врача дробно и под наркозом, имея наготове шприц и адреналин.

8.1. Адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД-анатоксин).

АД-анатоксин представляет собой очищенный от балластных веществ фильтрат бульонной культуры дифтерийной палочки, обезвреженный при помощи формалина и тепла, адсорбированный на гидроокиси алюминия. В качестве консерванта препарат содержит 0,01% мертиолята или 0,25% фенола.

8.2. Адсорбированный дифтерийный и столбнячный анатоксин (АДС-анатоксин). АДС-анатоксин представляет собой смесь очищенного дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

Введение АДС-анатоксина стимулирует выработку антитоксического иммунитета против дифтерии и столбняка. Препарат используют для профилактики дифтерии у детей, подростков и взрослых.

8.3. Адсорбированный дифтерийный и столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М). Применяют для плановых ревакцинаций детей и взрослых. Уменьшение количества антигенов рассчитано на предупреждение аллергических реакций.

8.4. Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-вакцина). АКДС-вакцина представляет собой ассоциированный препарат, содержащий взвесь коклюшных микробов 1 фазы, убитых формалином и мертиолятом и очищенных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

АКДС-вакцину применяют для создания антитоксического противодифтерийного иммунитета.

Зарубежные вакцины:

- Тетракокк 0,5 (Франция). Адсорбированная вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка, полиомиелита.

- Д.Т.Вакс (Франция). Адсорбированная вакцина для профилактики дифтерии и столбняка.

- Имовакс ДТ Адюльт (Франция). Адсорбированная вакцина для профилактики дифтерии и столбняка для ревакцинации взрослых.

Схема 4