Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Назначение.

Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.

Компоненты:

1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;

2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;

3) коньюгат — мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,

4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

— положительная (сыворотка с НВе Ад);

— отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 37 «С.

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата.

5) Инкубация 1 час при 37 «С.

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.

Механизм

Реакция протекает в три фазы:

1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад — агл\ НВз АТ).

2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.

Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:

1) исследуемый материал — сыворотка крови;

2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная;

- отрицательная.

Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.

3) Отмывание.

4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.

5) Инкубация 30 минут при 37 «С.

6) Отмывание.

7) Внесение ОФД. Механизм

Реакция протекает в 3 фазы:

1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).

2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Реакция иммуноблотинга

Разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ Ыо* — промокать, пягно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления спектра антител к антигенным смесям Относится к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Принцип метода на примере выявления антител к ВИЧ Реакция проводится в несколько этапов:

1) Антигены, экстрагированные из исследуемого объекта — ВИЧ (белки-р гликопротеины-др), подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле — разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2) Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной, и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигена.

Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге Мембрану разрезают на полоски (стрипы).

3) Стрип с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4) Сгрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

5) Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют зоне локализации комплекса АГ-АТ.