Определение окисления маннита
Принцип. При окислении маннита в аэробных условиях, образуется уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется с помощью индикатора.
Ингредиенты. Для постановки опыта рекомендуется плотная (1,8% агара) среда с индикатором ВР и среда Хью-Лейфсона, содержащие 1% маннита. Среду разливают в чашки Петри.
Ход исследования.
Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов сеют на среду бляшками (не более 16 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют при 370 С, результаты регистрируют через 1 сутки. Появление желтого окрашивания вокруг макроколонии свидетельствует о положительной реакции.
Фаготипирование штаммов S. aureus .
Для внутривидового дифференцирования S. aureus применяется метод фаготипирования, позволяющий получить фаговую метку большинства штаммов и с большей долей вероятности решить вопрос об идентичности или различии сопоставляемых культур, что очень важно для выявления источников и путей распространения стафилококковой инфекции.
Сухие фаги Международного набора (22 фага) выпускаются предприятием по производству бактерийных препаратов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. В каждую коробку вложена инструкция по применению фагов и учету результатов.
Принцип. Штаммы S. aureus обладают избирательной чувствительностью к литическому действию ряда стафилококковых бактериофагов, составляющих Международный набор типовых фагов. Чувствительность исследуемого штамма к одному или нескольким типовым фагам определяет фаготип штамма, т.е. его фаговую метку.
Таблица 3
Схема идентификации S. Aureus.
| № варианта | Наличие | Ферментация маннита в анаэробных условиях | Принадлежность штамма к виду | |||
| пигмента | лецитиназы | коагу-лазы | ДНК-азы | |||
| + | + | + | Да | |||
| - | + | + | Да | |||
| + | - | + | Да | |||
| - | - | + | ? | |||
| 4а | - | - | + | + | Да | |
| 4б | - | - | + | - | Нет | |
| 4в | - | - | + | + | Да | |
| 4г | - | - | + | - | Нет | |
| - | - | - | Нет | |||
| - | + | - | Нет | |||
| + | - | - | Нет | |||
| + | + | - | ? | |||
| 8а | + | + | - | + | Да | |
| 8б | + | + | - | - | Нет | |
| 8в | + | + | - | + | Да | |
| 8г | + | + | - | - | Нет |
Таблица 4 Схема идентификации S. epidermidis и S. Saprophyticus
| Устойчивость к новобиоцину | Фосфатаза ¦ | Окисление маннита | |
| S. epidermidis | - | + | - |
| S. saprophyticus | + | - | + |
Схема идентификации стафилококков.
День 1. Посев исследуемого материала на МЖСА или кровяной агар.
День 2. А. Учет наличия лецитиназы и пигмента (МЖСА), гемолиза (кровяной агар).
Б. Приготовление и просмотр окрашенных по Граму мазков.
В. Постановка и учет каталазной реакции.
Г. Отсев чистой культуры на косой агар.
День 3.
А. Окончательный учет наличия пигмента.
Б. Постановка теста на ферментацию глюкозы в анаэробных условиях.
В. Постановка реакции плазмокоагуляции и предварительный учет ее результатов.
Г. Отсев чистой культуры на бульон.
День 4.
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Окончательный учет реакции плазмокоагуляции и сопоставление ее результатов с результатами определения лецитиназы и пигмента (см. табл. 3). В зависимости от этого: а) при вариантах 1, 2 и 3 штамм идентифицируется как S. aureus - проводится фаготипирование; б) при вариантах 5, 6 и 7 штамм не относится к S. aureus - проводится его дальнейшая идентификация: постановка тестов на устойчивость к новобиоцину (посев бульонной культуры), окисление маннита, тест на фосфатазу (посев агаровой культуры); в) при вариантах 4 и 8 идентификация еще невозможна; постановка тестов на ДНК-азу или ферментацию маннита в анаэробных условиях.
День 5.
А. Предварительный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет результатов фаготипирования S. aureus (см. пункт А дня 3).
В. Учет результатов определения устойчивости к новобиоцину, окисление маннита, фосфатазы (см. пункт Б дня 3); штамм идентифицируется либо как S. epidermidis, либо как S. saprophyticus, либо как S. spp. (табл. 4). Идентификацию можно считать окончательной при положительном результате анаэробной ферментации глюкозы.
Г. Учет результатов определения ДНК-азы (см. пункт Б дня 3); при вариантах 4а и 8а (табл. 3) ход исследований тот же, что в пункте А дня 3; при вариантах 4б и 8б ход исследований тот же, что в пункте Б дня 3.
Д. Учет анаэробной ферментации маннита (см. пункт Б дня 3).
День 6.
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
В. Учет результатов фаготипирования S. aureus и результатов определения устойчивости к новобиоцину, окисления маннита, фосфатазы коагулазонегативных стафилококков (раздел Б, день 4).
День 7.
А. Окончательный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
День 8.
А. Окончательный учет ферментации маннита, далее ход исследований как в разделе Г дня 4. Если положительный результат ферментации маннита получен ранее, то сроки исследования сокращаются.
День 9.
Учет результатов (см. раздел В дня 5).
1. Среда Хью-Лейфсона - см. раздел 3.2.
2. Среда с индикатором ВР и одним из углеводов - см. раздел 3.2.
3. Тест на каталазу - см. раздел 3.3.
ГЛАВА 13
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ СЕМЕЙСТВА Streptococcaceae.
Согласно классификации, представленной в "Кратком определителе бактерий Берги" (М., 1980 г.) семейство Streptococcaceae объединяет 5 родов, из них три рода Streptococcus, Aerococcus, Gemella включают представителей, которые могут быть патогенными для человека.
Род Streptococcus объединяет обширную, широко распространенную в природе группу грамположительных, факультативно анаэробных микроорганизмов, облигатным признаком которых является отрицательный катализный тест. Род Streptococcus объединяет 21 вид стрептококков, различающихся по антигенным, биохимическим свойствам патогенности в отношении человека.
Облигатно патогенным для человека видом является S. pyogenes (группа А). Стрептококки этого вида являются возбудителями ряда острозаразных заболеваний, поражающих преимущественно детей и лиц молодого возраста. Они являются также причиной возникновений гнойно - воспалительных процессов разной локализации и этиологическим фактором таких хронических заболеваний, как ревматизм, диффузный гломерулонефрит.
S. pneumoniae (пневмококк) является возбудителем острых пневмоний, часто сопровождающихся бактериемией, менингитов у детей, острых отитов, гнойных конъюнктивитов и др.
Среди многочисленных условно - патогенных для человека видов стрептококка лидирующее место занимают S. agalactiae (группа В), S. faecalis и S. faecium (группа D).
Названные виды стрептококков являются одной из частых причин различных заболеваний урогенитального тракта, постхирургических гнойно - воспалительных процессов кишечника и брюшины, тяжелых пуэрперальных инфекций и инфекций новорожденных. Иногда они участвуют в этиологии и патогенезе подострого эндокардита. S. faecalis и S. faecium, по месту естественного их обитания, в кишечнике человека и кишечнике различных животных, выделены в отдельную группу "энтерококков".
Представитель рода Aerococcus - A. viridans выделяется при заболеваниях мочеполового тракта и при эндокардитах.
Представитель рода Gemella - вид G. haemolysans выделяется из секрета бронхов и слизи дыхательных путей.