ТЕМА: Морфология и ультраструктура вирусов. Клеточные культуры. Репродукция вирусов. Методы индикации вирусов.

ЦИКЛ VI «Общая вирусология»

Занятие № 1

ТЕМА: Морфология и ультраструктура вирусов. Клеточные культуры. Репродукция вирусов. Методы индикации вирусов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать морфологию и ультраструктуру вирусов, репродукцию вирусов, стратегию вирусного генома, этапы вирусологического метода, методы культивирования вирусов, методы индикации вирусов.

уметь учитывать цитопатическое действие (ЦПД) вирусов, учитывать и интерпретировать результаты цветной пробы, реакции гемагглютинации, реакции гемадсорбции.

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Классификация и таксономия вирусов

2. Морфология и ультраструктура вирусов

3. Особенность строения генома вирусов

4. Этапы взаимодействия вируса с клеткой

5. Вирусологический метод. Культивирование вирусов

6. Типы тканевых культур

7. Методы индикации вирусов

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать формы и типы симметрии вирусов

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Перечислить особенности строения вирусных РНК и ДНК

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3) Выписать этапы взаимодействия вируса с клеткой

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Выписать методы культивирования вирусов

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать классификацию и примеры однослойных тканевых культур _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6) Выписать способы индикации вирусов

7. Заполнить таблицу «Сравнительная характеристика простых и сложных вирусов».

Простые, или безоболочечные, вирусы	Сложные, или оболочечные, вирусы

8. Заполнить таблицу «Сравнительная характеристика вирусов и бактерий».

Признак	Вирусы	Бактерии
Размер в диаметре
Геном
Рост
Нуклеиновые кислоты
Ферменты

9. Заполнить таблицу «Типы взаимодействия вируса с клеткой».

Продуктивный процесс	Интегративный процесс	Абортивный процесс

10. Описать основные этапы вирусологического метода.

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Базовый текст

1.Классификация и таксономия вирусов

Русский ученый Д.И. Ивановский – первооткрыватель вирусов и основоположник вирусологии, в 1892 году описал необычные свойства возбудителей болезни табака – (табачной мозаики), которые проходили через бактериальные фильтры и были названы «фильтрующимися частицами».

Вирусы(от лат. virus – яд) – это мельчайшие микробы, имеющие геном, окруженный белковой оболочкой.

В основу классификации вирусов положены следующие категории (тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома, размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида, наличие оболочки (суперкапсида), чувствительность к эфиру и дезоксихолату, место размножения в клетке, антигенные свойства и др.

В вирусологии используют следующие таксономические категории:

· семейство (- viridae)

· подсемейство (- virinae)

· род (-virus)

Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviridae роду Influenzavirus A, B, C.

Вирусы поражают практически все живые организмы – бактерии (бактериофаги), грибы, растения, животных и человека.

Отличительные признаки вирусов:

● облигатные внутриклеточные паразиты

● не способны к самопроизвольному делению

● не имеют ферментов энергетического метаболизма и белоксинтезирующих систем

● наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК)

● отсутствие клеточного строения

● возможность интеграции в клеточный геном и репликации с ним

● разобщенным (дизъюнктивным) способом размножения (репродукции) – только в живой клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы (табл. 33).

2.Морфология и ультраструктура вирусов

Формы существования

●вирион– сформированная вирусная частица, существует вне клетки, содержит нуклеиновую кислоту, защитную протеиновую оболочку (капсид), структурные белки, ферменты;

● вирус –внутриклеточная форма, представлен нуклеиновой кислотой или нуклеокапсидом

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы (18-400 нм) и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Размеры вирусов изучают методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования, а также с помощью электронной микроскопии. Наиболее мелкими вирусами являются парвовирусы (18 нм) и вирус полиомиелита (20 нм), наиболее крупным - вирус натуральной оспы (350 нм).

Таблица 33. Сравнительная характеристика вирусов и бактерий

Признак	Вирусы	Бактерии
Размер в диаметре	От 18 до 400 нм	От 1000 нм
Геном	От 4 до 200 генов	От 3000 генов
Рост	Только внутри клеток	Большинство свободноживущие
Нуклеиновые кислоты	Содержат один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК)	Всегда содержат два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК)
Ферменты	Небольшое количество	Много разнообразных

Форма вирионов может быть различной:

· палочковидная (вирус табачной мозаики)

· пулевидная (вирус бешенства)

· сферическая (вирусы полиомиелита, ВИЧ)

· нитевидная (филовирусы)

· в виде сперматозоида (многие бактериофаги).

Генетический материал вирусов покрыт белковой оболочкой, называемой капсидом. Он состоит из субъединиц, капсомеров. Число капсомеров строго специфично для каждого вида и зависит от размеров и морфологии вирионов. Капсид защищает нуклеиновую кислоту вируса от внешних воздействий и обеспечивает адсорбцию и проникновение вируса в клетку через взаимодействие с клеточными рецепторами. Комплекс капсида и вирусного генома называют нуклеокапсидом. Капсид или нуклеокапсид (нуклеиновая кислота+капсид) могут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или двойной (смешанный) тип симметрии.

· Икосаэдрический тип симметрии - нуклеиновая кислота окружена капсомерами, образующими фигуру икосаэдра – 20-гранника, определяющими сферическую форму вирусов (аденовирусы, герпесвирусы, пикорнавирусы)

· Спиральный тип симметрии - взаимодействие нуклеиновой кислоты и белка осуществляется по одной оси вращения, определяющими палочковидную форму (парамиксовирусы, рабдовирусы).

· Сложный (смешанный) тип, двойная симметрия - представляет собой комбинацию кубического и спирального типа симметрии (бактериофаги).

В состав нуклеокапсидов также входят внутренние белки, обеспечивающие правильную упаковку генома, а также выполняют структурную и ферментативную функции. Вирусные ферменты делятся на вирионные и вирусиндуцированные. Первые входят в состав вирионов и участвуют в транскрипции и репликации (обратная транскриптаза ретровирусов), вторые закодированы в вирусном геноме (ДНК-полимераза герпесвирусов). Вирионные ферменты также подразделяют на две функциональные группы: ферменты первой группы обеспечивают проникновение вирусных нуклеиновых кислот в клетку и выход дочерних популяций; ферменты второй группы участвуют в процессах транскрипции и репликации вирусного генома.

Различают просто устроенные вирусы (безоболочечные) и сложно устроенные вирусы(оболочечные). «Одетые» вирусы могут содержать поверх капсида особую оболочку - суперкапсид, организованный двойным слоем липидов и специфичными вирусными белками, наиболее часто образующими выросты-шипы, пронизывающие билипидный слой (табл. 34).

Таблица 34. Простые и сложные вирусы

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом (от лат. сapsa — футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирусинфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок, способствующий взаимодействию суперкапсида и белков нуклеокапсида.

3.Особенность строения генома вирусов

Вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты!!! (в отличие от клеток). Различают ДНК- и РНК-содержащие вирусы. Вирусы обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор генов за исключением ретровирусов, которые обладают диплоидным геномом.

Геном содержит от шести до нескольких сотен генов и представлен различными видами нуклеиновых кислот: двухнитевыми (герпесвирусы), однонитевыми (парамиксовирусы), линейными (пикорнавирусы), кольцевыми (гепадновирусы), фрагментированными (ортомиксовирусы).

Геном вирусов способен включаться в геном клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов, например, вируса герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды.

Среди РНК-содержащих вирусов различают:

1. вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом

Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную (геномную) функцию и функцию информационной РНК (иРНК).

2. вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом

Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную (геномную) функцию.

Проникновение

а) путем слияния оболочки вириона с мембраной клетки, характерно для некоторых оболочечных вирусов (парамиксовирусов, ретровирусов, герпесвирусов)

б) путем эндоцитоза (пиноцитоза) в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячивается с образованием внутриклеточной вакуоли (эндосомы), содержащей вирус.

3. Освобождение нуклеиновых кислот (депротеинизация) – “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты. В результате депротеинизации удаляются поверхностные структуры вируса и высвобождается его внутренний компонент, способный вызвать инфекционный процесс.

4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса. Синтез нуклеиновых кислот и белков вируса разобщен во времени и пространстве, т.к. осуществляется в разных частях клетки. Такой способ размножения вирусов называется дизъюнктивным.

Синтез белков в клетке осуществляется благодаря процессам транскрипции – переписывания генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность информационной РНК (иРНК или мРНК) и трансляции – механизмов, при помощи которых последовательность нуклеотидных оснований мРНК переводится в специфическую последовательность аминокислот в синтезируемом полипептиде на рибосомах клетки хозяина.

5. Сборка вирионов – многоступенчатый процесс, включающий в себя соединение всех компонентов вириона.

Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и в образовании нуклеокапсидов. У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, которые взаимодействуют с модифицированными мембранами клеток (будущей липопротеиновой оболочкой вируса). У минус-нитевых РНК вирусов в сборку вовлекается матриксный белок (М-белок), который расположен под модифицированной клеточной мембраной.

6. Выход вирусных частиц из клеткивзрывным путем или почкованием, экзоцитозом. Полный цикл репродукции вирусов завершается через 5-6 ч (вирус гриппа) или через несколько суток (вирус кори). По взрывному пути выходят из клетки просто устроенные вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки. Из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. Почкование, экзоцитоз характерны вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид транспортируется к клеточным мембранам, в которые уже встроены вирусоспецифические белки. Затем в области контакта нуклеокапсида с клеточной мембраной начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложно устроенного вируса. Клетка способна длительное время сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство.

Таблица 35. Методы диагностики вирусных инфекций

1. Вирусоскопический метод
а) световая микроскопия	применяется для обнаружения крупных вирусов (оспы) в окраске по Морозову и внутриклеточных вирусных включений в окраске по Туревичу и Муромцеву
б) электронная микроскопия	дает возможность изучить ультраструктуру вириона
е) метод иммунной элек­тронной микроскопии в основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сыворот­кой	в результате реакции образуется микропре­ципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых своеобраз­ным «венчиком»
г) иммунофлюоресцентный метод (прямой и не­прямой) с использованием флюоресцирующих сывороток	при положительной реакции в люминес­центном микроскопе наблюдается специ­фическое свечение. Применяется для экспресс-диагностики.
2. Вирусологический метод Этот метод основан на культивировании виру­сов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов и их последующей индикации и идентификации.
Индикацию вирусов осуществляют 1. по характеру специфичес­ких поражений оболочек и тела эмбриона 2. по феномену гемагглютинации 3. по цитопатическому действию вируса (ЦПД) 4. по образованию в клет­ках включений 5. по образованию бляшек 6. по феномену гемадсорбции 7. по «цветной» реакции	Для сероидентификации вирусовиспользуют материал от больного (смыв из носоглотки), аллантоисную или амниотическую жидкость заражённого кури­ного эмбриона, культуру клеток и ставят реакции: а) торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА) б) торможения (задержки) гемадсорбции (РТГАд) в) связывания комплемен­та (РСК) г) нейтрализации (РН) д) ИФА Для генетической идентификации – ПЦР, МГ
3. Серологический метод
Применяется для обнаруже­ния в сыворотке крова боль­ного специфических проти­вовирусных антител в реакциях (РТГА, РСК, ИФА и др)	определяют титр антител в парных сыворотках в этих реакциях используются антиге­ны вирусов (диагностикумы)
4. Биологический метод
Основан на использовании чувствительных лабораторных животных	применяют для культивирования, индикации и идентификации вирусов, изучение клинических симптомов и патоморфологических изменений

Вирусологический метод направлен на выделение и идентификацию вируса и является «золотым стандартом» в диагностике вирусных инфекций. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, в связи с этим, вирусологический метод имеет ряд принципиальных особенностей. Схема вирусологического метода включает ряд последовательных этапов: 1) забор, транспорт и подготовка исследуемого материала, 2) культивирование, 3) индикация и 4) идентификация вирусов (табл. 36).

При заборе материала для исследований необходимо отбирать образцы с учетом локализации первичной репликации и ритма циркуляции возбудителя. Образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно, при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 суток) образцы сохраняют на льду, при более длительной – при tºC -50ºC.

Таблица 36. Схема вирусологического метода

Подготовка исследуемого материала	Клинический материал обычно содержит смесь бактерий и вирусов, с целью их разделения проводят: · фильтрацию (бактериальные фильтры) · центрифугирование · антибактериальную деконтаминацию (антибиотики широкого спектра действия – бензилпенициллин, стрептомицин и др.)
Культивирование вирусов	Вирусы размножаются только в живых клетках, соответственно используются следующие способы культивирования: · куриные эмбрионы · лабораторные животные · культуры клеток (клеточные культуры) – первичные, полуперевиваемые, перевиваемые
Индикация вирусов	Цель данного этапа – выявление вируса. Вирусы являются ультрамикроскопическими микроорганизмами и для их визуализации используют специальные (опосредованные) методы: · цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов (деструкция монослоя культуры клеток, формирование внутриклеточных включений, синцития и симпластов и др.) · образования бляшек · реакции гемагглютинации (РГА) · гемадсорбции · «цветной» реакции (подавление метаболической активности)
Идентификация вирусов	После обнаружения вируса необходимо определить тип этого вируса. Существует два вида идентификации: · сероидентификация (вирус – неизвестный антиген, для его идентификации необходимы известные антитела – диагностические сыворотки) ИФА, РСК, РТГА, РН и др. · геноидентификация (определение генома) ПЦР, ДНК-гибридизация (МГ)

Типы тканевых культур

Типы клеточных культур

1. Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных. Их получают из клеток различных тканей путем размельчения и трипсинизации. Используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2. Линии диплоидных клеток (полуперевиваемые) пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более 40-50 пассажей (теряют исходные свойства). Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, не претерпевают злокачественной трансформации, но имеют ограниченную продолжительность жизни.

3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам. Наиболее удобны в вирусологической работе - линии опухолевых клеток Hela (рак шейки матки), Hep (рак гортани).

Методы индикации вирусов

Индикация вирусов – обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками.

Индикацию вирусовпроводят на основе следующих феноменов: ЦПД вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции, «цветной» реакции (табл.37).

Таблица 37. Методы индикации вирусов

ЦПД -видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов	Культура клеток ЦПД вируса
Включения -скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.
Бляшки, или “негативные” колонии- ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации (качественно-количественный).
РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.
Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты за счет включения в их оболочку гемагглютинина вируса.
“Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

Занятие № 2

Базовый текст

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакция торможения гемагглютинацииоснована на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ (РН)

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать (блокировать) поверхностные рецепторы (антигены) вирусов, в результате чего вирусы теряют способность проникать в живые клетки.

Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген (вирус) - антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия вирусов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген — антитело.

Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток: А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размножения вирусов; Б - ЦПЭ отсутствует в результате нейтрализации вирусов антителами.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатита В и др.

Твердофазный ИФА- вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом , и субстрат/хромоген для фермента. II. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.	I. Определение антител в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным антигеном	II. Определение антигена в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированными диагностическими антителами)

Конкурентный ИФАдля определения антигенов: искомый антиген(1) и меченый ферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела(3), сорбированные на твердой фазе.
Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

РАДИОИММУНЫЙ АНАЛИЗ (РИА)

Радиоиммунный анализ(РИА) -высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопом (125J, 14С, Н,51Сrи др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ (МГ)

Позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90°C) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°C вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченая радиоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют в специальным фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образуют между собой двойную спираль.

III. План практической работы

1. Учесть и зарисовать раннюю реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) в диагностике гриппа (см. механизм реакции в базовом тексте).

Метод диагностики:вирусологический

Компоненты: типоспецифические противогриппозные сыворотки (содержащие антитела к вирусам гриппа А, А1, А2 и В), исследуемый материал (вирус гриппа, культивированный в тканевых культурах), изотонический раствор хлорида натрия, 1% суспензия куриных эритроцитов.

Постановка:Разведение соответствующих типоспецифических противогриппозных сывороток в ряде лунок, используя 0,9% раствор NaCl (см. разведения на планшетке). В каждую лунку вносят по 0,2 мл исследуемого вируса. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую лунку вносят по 0,4 мл. 1% суспензии куриных эритроцитов. Инкубация в течение 2-х часов при температуре 37 °C.

Учет: Положительная реакция «+» – осадок с ровными краями в виде красной пуговки. Отрицательная реакция «-» - осадок с неровными краями в виде красного зонтика. Титр РТГА определяют по максимальному разведению, при котором наблюдается торможение гемагглютинация (красная пуговка).

Заключение: Вирусологический материал содержит вирус гриппа А2 в титре 1/320.

2. Учесть и зарисовать реакцию нейтрализации в диагностике полиомиелита по цветной пробе (см. механизм реакции в базовом тексте).

Метод диагностики:вирусологический

Компоненты: типоспецифические полиомиелитные сыворотки (содержащие антитела к вирусу полиомиелита типа 1, 2, 3), исследуемый материал (вирус гриппа, культивированный в тканевых культурах), культура клеток в питательной среде №199 и индикатор pH среды.

Постановка:Вируссодержащий материал смешиваетсяс соответствующими типоспецифическими полиомиелитными сыворотками в 3-х пробирках. Оставляется на 1 час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку с культурой клеток в питательной среде №199 с индикатором pH среды вносят смесь вируса с диагностической сывороткой. Инкубация в течение 4-9 дней при температуре 37 °C.

Учет: Положительная реакция «+»– пробирка с желтой средой (вирус нейтрализовался типоспецифической сывороткой, а клетки остались жизнеспособными, вырабатывающими кислые продукты метаболизма, изменяющие pH среды в кислую сторону, при этом цвет жидкости меняется с красного на желтый). Отрицательная реакция «-» - пробирка с красной средой (реакции нейтрализации не произошло).

Заключение:Вирусологический материал содержит вирус полиомиелита типа ­I.

3. Учесть и зарисовать ИФА в диагностике ВИЧ-инфекции (см. схему твердофазной ИФА в базовом тексте)

Ингредиенты реакции:исследуемая сыворотка для выявления антител к поверхностным антигенам (гликопротеинам) ВИЧ,лунки планшеток с сорбированным ВИЧ антигеном , антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом (пероксидазой хрена) и субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин - ОФД)

Постановка ИФА:В лунки планшетокс сорбированным ВИЧ антигеном добавляют исследуемую сыворотку больного. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. В каждую лунку вносят антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом (пероксидазой хрена). Выдерживают 60 мин при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. Затем добавляют субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин - ОФД).

Учёт ИФА.При образовании комплекса + + , субстрат (перекись водорода) расщепляется ферментом (пероксидазой хрена) на конечные продукты кислород и воду. В присутствии кислорода индикатор (ОФД) изменяет цвет продукта реакции — с бесцветного на желто-коричневый. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Определяют оптическую плотность содержимого каждой лунки (контрольных и рабочих) с помощью фотоколориметра.

1. Определение специфичности контролей: контроли специфичны, если

ОП «+» контролей >1, а ОП «-»<0,2.

2. Расчет ОП критической

ОП крит. = ср. знач. ОП К^- + 0,200

где ОП крит.- критическое значение оптической плотности; ср. знач. ОП К^--- среднее значение оптической плотности отрицательных контролей; 0,200 – коэффициент, устанавливаемый методом статистической обработки результатов на предприятии-изготовителе тест-системы.

3. Определение результата реакции:

результат положительный, если ОП рабочей лунки > ОП крит.,

результат отрицательный, если ОП рабочей лунки < ОП крит.

Заключение:Например, контроли специфичны и результат положительный, следовательно, в исследуемой сыворотке содержатся антитела к ВИЧ.

4. Зарисовать схему молекулярной гибридизации (МГ)

Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов.

Схема точечной гибридизации

1. ДНК наиболее типичного штамма метится изотопом ³H тритием или ³²P фосфором
2. Фрагментация и денатурация меченой ДНК
3. Исследуемая ДНК денатурируется, но не фрагментируется и иммобилизуется на твердой фазе, например на гранулированном агаре, мембранных фильтрах (нитроцеллюлозные или нейлоновые)
4. Инкубация исследуемой ДНК с меченой ДНК в жидкой среде. При гомологии фрагменты меченой гибридизируются с исследуемой, т.е. формируется двунитчатая структура
5. Для повышения точности метода применяют обработку гибридов специфическим ферментом – нуклеазой S₁, которая способна «отсеивать» от гибридных дублексов непрореагировавшие одноцепочечные участки
6. Отделение гибридов с помощью гидроксиаппатита, т.е. отмывка гибридов от балластного материала
7. Подсчет радиактивности на счетчиках с определением % гомологии ДНК

Недостаток метода - короткий период полураспада фосфора и наличие специфического оборудования.

Блот-гибридизация

Метод выявления фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом в агарозе. ДНК предварительно нарезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз из суммарной ДНК. Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и обработка мечеными зондами.

Гибридизация in situ

Позволяет выявить нуклеиновые кислоты в инфицированных клетках. Клетки, после денатурации нуклеиновой кислоты, обрабатываются немечеными зондами, формирующими гибридные двунитчатые структуры, затем обработка меченой флюорохромом сывороткой к гибридомам. При наличие в материале незначительных количеств нуклеиновой кислоты вирусов применяется ПЦР.

5. Зарисовать схему постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) ( см. базовый текст)

Фрагмента участка ДНК)

1. Денатурация (разрыв водородных связей и трансформация двухцепочечной ДНК в одноцепочечные) осуществляется при температуре 93-95ºC в течение 1-3 минут

2. Присоединение (отжиг) праймеров (олигонуклеоитидные генетические затравки) происходит комплементарно к соответствующи