Микробиологические и вирусологические лаборатории

Микроскоп и иммерсионная система

В настоящее время существует несколько типов микроскопов, с соответствующими приспособлениями, позволяющими проводить несколько видов микроскопирования:фазово-контрастное, световое, темнопольное, люминисцентное, электронное.

Микроскоп (греч. micros- малый, scopeo- смотреть) - оптический прибор, который предназначен для увеличения микрообъектов и позволяет изучать микромир, невидимый невооруженным глазом. Применение микроскопов позволяет видеть форму, структуру и размеры объектов от 0,2-0,3 мкм (световые микроскопы), до 0,1-0,2 нм (электронные микроскопы). Именно достижения в области микроскопирования позволили выявить и описать не только бактерии и вирусы, но и такие мельчайшие безъядерные инфекционные частицы как прионы и др.

Световой микроскоп.

В микробиологической практике пользуют световые микроскопы марок МБИ, МБР, Биолам Р-1 и др. Наибольшее увеличение этих микроскопов 900 крат. Микроскопы имеют механическую, осветительную и оптическую части. Механическая часть (тубусодержатель, винты, клеммы, кронштейн, тубус и пр.) предназначена для поддержания и регулирования оптической и световой систем микроскопа. Осветительная часть - зеркало и конденсор с диафрагмой - предназначена для отражения световых лучей с помощью зеркала, после чего лучи направляются к объективу и далее к окуляру, для собирания лучей от зеркала в фокус в плоскости рассматриваемого препарата. Определенную помощь в преломлении лучей света оказывает иммерсионное масло, наносимое на предметное стекло (на мазок). Объем лучей регулируется диафрагмой. Оптическая часть - (объективы, окуляры) предназначена для увеличения объекта исследования, согласно применяемым маркам объективов и окуляров. Объектив- это система линз, дающих основное увеличение. Они маркированы согласно даваемым ими увеличениям, например, х8, х40, х90. Окуляры имеют две линзы:нижнюю - собирательную и верхнюю - главную. Окуляры фокусируют изображение и увеличивают его, согласно маркировке, например, х5, х7, х10, х12, х15. Общее увеличение микрообъекта определяется с учетом маркировки объектива и окуляра, например, объектив х90 и окуляр х10 дают общее увеличение - 900 крат.

Иммерсионная система микроскопа предназначена собрать лучи от источника света в объектив. Объективы световых микроскопов могут быть "сухими" - с большим фокусным расстоянием и бывают "иммерсионными", т.е. погружаемыми в масло. В качестве масла иммерсионного используют кедровое.

Применение иммерсионного масла необходимо для уравнивания показателей преломления света от предметного стекла и пространства между стеклом и объективом. Показатель преломления предметного стекла - 1,52. Показатель преломления воздуха - 1,0, а масла иммерсионного - 1,515. Применение кедрового масла (касторового, вазелинового) предохраняет от рассеивания лучей света, преломляющихся от поверхности стекла. Это увеличивает четкость изображения.

Темнопольная микроскопия. Для этого вида микроскопирования используют те же световые микроскопы, но обычные конденсоры заменяют на специальные (пара-болойд- или кардиойд-конденсор). Темнопольный конденсор характерен тем, что задерживает прямые лучи и пропускает только краевые косые лучи. При сильном боковом освещении получается изображение как бы светящегося объекта на темном фоне. Это эффект дифракции света (Тиндаля). Косые лучи не попадают в глаз исследователя и поле остается темным. В окуляр попадают только те лучи света, которые отражаются от исследуемых объектов. Этим методом удобно исследовать подвижные, плохо окрашиваемые микроорганизмы, в живом состоянии.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот вид микроскопирования требует особый конденсор (КФ-1, 4) и специальный осветитель (ОИ-7, ОИ-19 и др.), при использовании обычного микроскопа. Исследование в световом микроскопе нативного неокрашенного микроорганизма практически невозможно. Для этого применяют фазово-контрастное микроскопирование, когда прозрачные объекты приобретают высокую контрастность изображения. Оно может быть позитивным,когда на светлом поле видно темно изображение объекта,и может бытьнегативным,когда на темном поле видно светлое изображение объекта.

При микроскопировании этими способами освещение должно отвечать требованиям, предъявляемым при световой, фазовой, темнопольной микроскопии, микрофотографирова-нии.

Люминисцентная микроскопия. Люминисценция - это свечение веществ в результате воздействия световым или другими видами излучений. Если освещать люминисцирующий объект ультрафиолетовым светом, то он будет излучать лучи разного цвета. Поскольку таких самосветящихся объектов достаточно мало, то в работе следует применять «вторичную» люминисценцию, т.е. предварительное мечение объекта специальными люминисцирующими красителями - флюорохромами. Обычно флюорохромами метят антисыворотки и тогда свечение собирается вокруг гомологичных по специфичности микробов в виде светящегося ободка. Люминисцентная микроскопия занимает определенную нишу в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, позволяя исследовать микроорганизмы в живом состоянии и малых концентрациях - непосредственно в исследуемом материале

Электронная микроскопия. Для проведения электронной микроскопии применяют специальные, так называемые электронные микроскопы. В электронном микроскопе вместо световых волн используют поток электронов, длина волн которых меньше длины света в 100000 раз. Электронный микроскоп дает увеличение в 100000-200000 раз. Разрешающая способность электронного микроскопа 0,1-0,2 нм. Источником электронов в таком микроскопе является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с катодом в виде раскаленной нити и анодом - цилиндром). Электронный микроскоп применяют для изучения тонкого строения микроорганизмов, вирусов, прионов и др. субмикроскопических структур и объектов. Это микроскоп просвечивающего типа. Существуют электронные микроскопы сканирующего типа, с помощью которых проводят изучение рельефного строения внешней поверхности субмикроскопических объектов.

Методы микроскопии

Метод микроскопии позволяет изучать морфологию микроорганизмов, подвижность, отношение микробов к красителям и пр. Обычно микроскопии подвергают специально приготовленные препараты бактерий в живом или окрашенном виде (фиксированные или убитые микробы). Наибольшее распространение в микробиологии получила микроскопия окрашенных препаратов - мазков, хотя исследование микроба в живом виде имеет свои неоспоримые преимущества.

Питательные среды

Питательные среды - это искусственно приготовленный комплекс питательных веществ, предназначенный для культивирования микроорганизмов. Это искусственно приготовленная среда обитания микробов. Такие питательные среды обычно готовят на определенной основе (агар, мясо-пептонный бульон и пр.), с учетом пищевых потребностей культивируемых на них микробов. Они бывают простого и сложного состава и готовятся для лабораторных или промышленных целей.

Питательные среды должны:

1. Содержать в нужном количестве весь набор элементов, которые предназначены для восполнения структуры микроорганизмов. Они должны быть в усвояемых химических соединениях:многоатомные спирты, углеводы, органические кислоты и пр. - это источники углерода; аммонийные соединения, аминокислоты, белки, пептиды - источники азота;соли фосфорной и др. кислот - источники микроэлементов;витамины и др. - факторы роста,а также должны содержать соли, воду.

2.Иметь оптимальную: влажность (не мене 20 % воды), вязкость, рН среды (диапазон от 4,5 до 8,5), изотоничность (для большинства - 0,85 %, для голофилов - 3 %), окислительно-восстановительный потенциал Rh (для анаэробов 0,120-0,060, для аэробов более 0,90).

3. Питательная среда должна быть прозрачной.

4. Питательная среда должна быть стерильной.

Питательные среды по консистенции могут быть жидкие и полужидкие (0,3-0,7 % агара) и плотные (1,5-2,0 % агара).

Для приготовления питательных сред применяют естественные продукты животного, яичного, рыбного и растительного происхождения или искусственные ингредиенты в строго определенных количествах и такие среды называют синтетическими, а при добавлении к ним еще и естественных продуктов - полусинтетическими. Питательные среды из естественных продуктов имеют неопределенный химический состав и требуют добавок некоторых веществ - ингибиторов посторонней флоры и пр. В состав питательных сред на синтетической основе входят аминокислоты, витамины, минеральные соли и др. известные химические элементы в известных количествах. В полусинтетические среды кроме известных элементов входят пептон, дрожжевой экстракт и др. вещества.

Питательные среды по назначению бывают: консервирующие, обогащения, элективно-диагностические, универсальные и дифференциально-диагностические.

Консервирующие или транспортные среды предназначены для транспортировки в баклабораторию материала первично засеянного у постели больного.

Универсальные среды предназначены для роста неприхотливых микробов или добавки таких сред как основы к более сложным.

Среды обогащения предназначены для накопления одних микробов при подавлении роста других, что бывает очень важным, т.к. первичный материал часто засевают на твердые среды и обогащения одновременно.

Элективно-диагностические среды предназначены для первичного выделения групп или родов микроорганизма с целью последующей дифференцировки и идентификации на других средах.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для окончательного ответа о виде и подвиде выделенной чистой культуры.

Элективность диагностических сред выделения бактерий достигается за счет добавления в их состав определенных ингибиторов для других видов микроорганизмов (желчь, азид натрия, теллурит калия, рН, соль, антибиотики и др. вещества). Проводимая далее с чистой культурой дифференциальная диагностика бактерий основана на определении особенностей, например, биохимических и др., путем внесения в среду определенных субстратов (сорбита, мальтозы, сахарозы и др. - это углеводы; орнитина, лизина, аргинина и др. – это белки; солей, мочевины и пр.).

В настоящее время на разные группы микробов выпускают в стране и за рубежом тесты нескольких поколений и порядков: 1-порядка - тест-система, расфасованная по лункам полистироловых пластин питательная среда (АР1-20E, Eneroes, MMТE1 и др.). 2-порядка - системы в бумажном индикаторном исполнении (Micro-10, M:N:ТEK и др.), 3 -порядка - тест-система жидкая, приготовленная ex тempore.

Приготовление питательных сред

Ввиду множества прописей приготовления питательных сред, в этом разделе приводим примеры приготовления наиболее распространенных из питательных сред.

Компоненты для питательных сред. Натуральные питательные среды целиком состоят из животного сырья (свернутая сыворотка, кровь и др.) или с наполнителем (агар, пептон, желатин и др.). Для питательных сред используют:картофель,кровь, молоко, яйца, рыбную муку, дрожжи и пр. и готовят из них экстракты и настои (полуфабрикаты, гидролизаты и перевары, например, Хоттингера) и пр. Это источники белковых, азотистых и др. веществ. В качестве минеральных солей используют:NaCI, KHPO_4, MgSO4 и др. В качестве сахара – глюкозу либо лактозу, мальтозу, сахарозу и пр. Из индикаторов применяют Андреде (0,5 г кислый фуксин, 1N NaOH 17 мл, дистиллированная вода до 100 мл), Кларка (1,5 % раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.), а также нужно использовать аминокислоты, витамины и др. ингредиенты.

Для искусственных сред применяют определенные элементы в строго известных дозах, которые оптимальны для конкретных микроорганизмов.

Некоторые рецепты приготовления питательных сред:

Транспортные среды

1. Среда с теллуритом калия. Агаровую основу 0,1 % разливают в пробирки по 4 мл. Стерилизуют при 1 атм 20 мин. В каждую пробирку по правилам асептики вносят 0,5-1,0 мл сыворотки КРС и по 0,05 мл 2 % раствора теллурита калия. Срок хранения 10 дней.

2. Среда Тига (глицериновая смесь). Смешивают 1 л глицерина и 2 л 0,85 % раствора хлорида натрия и 15-20 % раствора фосфата натрия в количестве, чтобы рН был 7,8-8,0. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 20 мин при 0,5 атм.

3. Глицериновый консервант. Это разновидность глицериновой смеси, с содержанием солей лития.

Среды обогащения

1. Селенитовая среда. Смешивают пептон- 0,5 г, селенистокислого натрия - 0,4 г, фосфата натрия однозамещенного - 0,7 г, фосфорнокислого двузамещенного натрия - 0,7 г, лактозы - 0,4 г, дистиллированной воды - до 100 мл. Разливают по пробиркам и флаконам, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

2. Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают 90 мл бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гупосульфита натрия.

3. Раствор Люголя:дистиллированная вода 20 мл, йодида калия 20 г, йода 25 г. После растворения доливают дистиллированной воды до 100 мл. Раствор гипосульфита натрия:в мерный цилиндр насыпают 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, перемешивают, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Универсальные среды.

1. Мясо-пептонный бульон.

а) Приготовление мясного экстракта:

500 г мяса (без костей, жира и сухожилий) разрезают на мелкие кусочки (пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды. Выдерживают сутки в холодильнике или 2 ч в термостате при 37⁰ С. Отжимают мясо через марлю, кипятят на огне 5 мин и дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема

б) Приготовление мясопептонного бульона:

В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г (1 %) пептона и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают слабощелочную реакцию 10 % раствором соды с помощью лакмуса (красная лакмусовая бумага слегка синеет). Кипятят 30-40 мин на огне. Дают остыть, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Определяют концентрацию водородных ионов калориметрическим путем - в компараторах, подправляют рН 10 % раствором щелочи или уксусной кислоты. Кипятят, остужают, фильтруют, разливают по 5-6 мл в пробирки и по 50-100 мл в колбы, стерилизуют до 20 мин в автоклаве при 120^о С.

2. Приготовление мясопептонного агара:

К бульону прибавляют 2- 3 % измельченного агара, нагревают до растворения агара, остужают агар до 50⁰ С. Для осветления вносят белок 1 куриного яйца, смешивают его с двойным объемом холодной воды и вносят в агар, автоклавируют 45 мин при 115⁰ С для осаждения хлопьев белка. Фильтруют агар еще не остывший, разливают в стеклянную посуду. Вновь стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120⁰ С. Готовят скошенный или прямой агар, остужая пробирки (флаконы, колбы) до застывания агара.

3. Приготовление перевара (гидролизат) Хоттингера:

а) Мясо (1 кг) нарезают кусочками, добавляют двойной объем воды и кипятят 15-20 мин, извлекают, пропускают через мясорубку и опускают снова в тот же бульон, подщелочив его до рН 8,0. Охлаждают до 40⁰ С, добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в объем 100 г на 1 л воды.

б) Фарш перемешивают, подщелачивают, переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой, оставляют треть бутылки свободной. Вносят 1-3 % хлороформа, закрывают бутыль, встряхивают, открывают бутыль на 1 мин для выпускания хлороформа

в) Проверяют рН (через 1 ч после добавления фермента) и подщелачивают до рН 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре. Первые дни подщелачивают и встряхивают. За несколько дней до окончания экспозиции бутыль не встряхивать.

г) Правильный перевар будет иметь пылевидный осадок и соломенно-желтый раствор. Содержание азота 11,00-12,00 г на 1 л. Перевар фильтруют через полотнянный фильтр или бумажный, разливают в бутыли и колбы и стерилизуют в течение 30 мин при 120⁰ С.

4. Приготовление бульона Хоттингера:

К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 800 мл дистиллированной воды, вносят 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают рН 7,4-7,6. Разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют в течение 20 мин при 120⁰ С. Содержание аминного азота - 1,00-1,20 г на 1 л.

5.Приготовление агара Хоттингера:

К 1 л бульона Хоттингера в колбе объемом 2-3- л прибавляют 18-25 г мелко нарезанного агара (1,5-2,0 %). Будьон кипятят, постоянно его перемешивая, до расплавления агара. Устанавливают рН 7,4-7,6 . Расплавленный агар фильтруют через несколько слоев марли и разливают в колбы и пробирки. Посуду расставляют в специальную тару и стерилизуют в течение 20 мин при 120⁰ С в стерилизаторе. Затем стерильный агар в посуде используют для посева микроорганизмов или расплавляют, разливают в более мелкую посуду и вновь стерилизуют.

Генетика бактерий

Изменчивость бактерий обусловлена достаточно многочисленными процессами рекомбинаций и мутаций хромосом, а также за счет плазмид, транспозонов, Is-частиц и умеренных фагов. Изменчивость бактерий может быть наследуемой и приводить к появлению новых или исчезновению некоторых свойств бактерий. Мутации условно поделены на естественные и индуцированные, наводимые с помощью мутагенов

Индукция мутаций под воздействием ультрафиолетового облучения

В качестве источника УФ0 используют бактерицидную лампу ВУФ-15, устанавливают ее на расстоянии 60 см от центра облучения объекта. Облучение желательно проводить при красном цвете или в темноте.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основе которой устанавливают оптимальную мутационную дозу, равную 0,1-1,0 % от числа выживших бактерий.

Для получения lac-мутантов E.coli испытуемую культуру предварительно выращивают в питательном бульоне в течение 14-18 ч. Концентрация бактериальных клеток должна быть 2х10⁸ в 1 мл. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 м раствора MgSO₄ и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объеме 40 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15 мин при 15⁰ С. После этого клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне и делают несколько разведений.. Пробирки с питательным бульоном инкубируют при 37⁰ С в течение 14-18 ч. Затем из разведений 10^-2-10^-5 по 0,1 мл высевают на плотную элективную питательную среду (в данном случае - Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика (ампициллин 10 мг на 1 мл, левомицетин 5 мг на 1мл).

На среде Эндо lac-мутанты E.coli образуют бесцветные колонии. Клетки E.coli, которые выросли на среде с указанной концентрацией антибиотиков, являются резистентными к нему. Параллельно делают контрольные посевы этой же культуры без облучения.

Постановка опыта трансформации. Реципиент - Bacillus subtilis Str^S (чувствитльный к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма Bacillus subtilis Str^R (устойчивый к стрептомицину). Среда - питательный агар, содержащий 100 ED в 1 мл стрептомицина.

В пробирки к 1 мл бульонной реципиентной культуры B.subtilis добавляют ДНК донора (1 мкг на 1 мл) для их инкубации при 37⁰ С в течение 30 мин. Далее в пробирки вносят 0,1 мг на мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния (для разрушения свободного ДНК) и выдерживают 5 мин. Для определения количества стрептомицин устойчивых бактерий, 0,1 мл неразведенной смеси засевают на питательную среду на чашки Петри. Для определения клеток реципиентной культуры из смеси готовят 10-ти кратные разведения в 0,85 % растворе хлорида натрия до 10^-5-10^-6 (для получения сосчитываемого количества колоний) и высевают по 0,1 мл на питательную среду без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти. Посевы инкубируют при 37⁰ С. На следующий день учитывают результаты. Определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных колоний к числу колоний реципиентного штамма.

Постановка опыта по специфической трансдукции. Реципиент - штамм E.coli lac^-, не имеющий В-галактозидазного оперона, контролирующего лактозу. Трансдуцирующий фаг - фаг dgal, в геноме которого часть генов замещена В-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, неспособным вызывать лизис кишечной палочки и обозначается как d(фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Элективная среда - Эндо.

К 1 мл 1 ч бульонной культуры реципиентного штамма вносят 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10^-6-10^-7 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 60 мин, а затем готовят ряд десятикратных разведений культуры. Из пробирки с разведением культуры 10^-6 делают высев по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют сутки, затем учитывают результат и вычисляют величину трансформации. Например, после посева 0,1 мл культуры в разведении 10^-6 на трех чашках, где выросло соответственно, 138, 170, 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, а на 1 и третьей чашках выросли колонии красного цвета, следовательно, частота трансдукции:

(5+1)х10х10⁶х (138+170+160):10х10⁶ = 6 :468 = 1^.10^-2

Постановка опыта конъюгации с передачей R-плазмиды. Плазмида контролирует множественную устойчивость к антибиотикам: Str, Tcn, Cmc (стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол). Донор - штамм E.coli K12 R⁺leu^-Str^RТcn^RCmc^R. Реципиент штамм E.coli K12 R^-leu^-Str^STcn^SCmc^S. Cреда минимальная глюкозо-солевая, содержащая эти антибиотики в концентрации 50 мкг в 1мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-х ч бульонной культуры реципиента и донора. Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл в чашки с элективной средой, где вырастают резистентные штаммы. Отсутствие роста донора можно объяснить потребностью в лейцине, а роста реципиента - в чувствительности к антибиотикам. Частоту образования трансконъюгантов определяют отношением их к числу реципиентных клеток. Например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10^-4 на глюкозо-солевую среду с лейцином получено 20 колоний, а при высеве смеси - 60 колоний трансконъюгантов. Частота формирования трансконъюгантов:

(60х10) : (20 х 10х10⁴) = 60х10² : 2х10⁶ = 3,0^.10^-4

Определение колициногенных факторов (col-плазмида). Исследуемые культуры E.coli засевают методом укола в питательную среду в чашки Петри (7-8 уколов в чашке). Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение суток. после чего на внутреннюю поверхность чашек Петри помещают кусочки ваты, смоченные хлороформом, в парах которого погибают бактерии.

По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного агара, который смешан с 0,2 мл часовой бульонной индикаторной культуры (чувствительной к данному колицину E.coli). Через 18-20 ч инкубации культуры появляются результаты опыта. Среди посевов индикаторной культуры появляются прозрачные зоны, соответствующие посевам исследуемой культуры.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашках Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицином. Посевы инкубируют при 37⁰ С сутки, после чего культуру убивают хлорамином. Затем по поверхности питательной среды в чашках Петри распределяют 3 мл расплавленного агара, смешанного с 0,2 мл 4-х часовой культурой E.coli неизвестного колицинотипа. Через 18-20 ч культивирования при 37^о С отмечают результаты действия колицина. Если вокруг посевов эталонного штамма появляются зоны просветления в росте исследуемой культуры, то это не будут идентичными колициногенами. В идентичной по колицинам культуре зон просветлений не будет.

Бактериофаг

Вирус, паразитирующий на бактериальных клетках, называют бактериофагом. По греч. phagein – пожирать, выражается в лизисе (растворении) бактериальных клеток. Бактериофаг имеет головку, в которой заключены ДНК или РНК и хвост с отростками.

Известны вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные бактериофаги могут лизировать бактерии с образованием новых фаговых частиц. ДНК умеренных фагов включаются в хромосому бактериальной клетки и передаются по наследству, придавая клетке-хозяину новые свойства. Такое взаимодействие фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие умеренные фаги, называют - лизогенными.

Действие фага строго специфично. Феномен действия вирулентных фагов проявляется просветлением взвеси бактерий в жидкой среде или отсутствием роста бактерий при посеве их на плотную среду газоном.

Большинство фагов проявляет видоспецифичность в отношении бактерий, хотя имеются и вариантные фаги, для определения фаговаров внутри вида бактерий.

На практике фаги применяют для:

1. маркировки культур при эпидемиологическом расследовании, определение фаговара,

2. диффренцировки бактериальных культур, установление видовой принадлежности,

3. фагодиагностики - выделение фага из фекалий больного,

4. фаготерапии - в отдельных случаях фаги применяют для лечения инфекционных заболеваний.

Метод титрования бактериофага:

1. Метод Аппельмана (серийных разведений).

Испытуемый фильтрат или известный бактериофаг разводят 10-ти кратно МПБ. Берут 10 пробирок с 4,5 мл МПБ в каждой. В первую вносят 0,5 мл исследуемого фага, содержимое перемешивают и 0,5 мл жидкости переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают содержимое и таким же образом переносят во все следующме пробирки. Получают разведения бактериофага от 10^-1 до 10^-8. В каждую пробирку, включая контроль, вносят по одной капле культуры, выросшей на МПБ. Для контроля берут 2 пробирки с МПБ, в одну вносят 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку - одну каплю микробной культуры (контроль культуры). Все пробирки инкубируют при 37⁰ С в течение 18 ч. Титр фага определяют по наибольшему разведению препарата, в котором обнаруживается литическая активность.

2. Метод Грациа (агаровых слоев).

В 5 чашек Петри заливают 1,5 % МПА с индикатором генцианвиолетом (0,1 мл 0,4 % раствора на 1 л среды). Агар в чашках подсушивают в термостате до полного удаления конденсата.

Готовят разведения исследуемого фага на физиологическом растворе от 10^-2 до 10^-9.

Готовят 5 пробирок, содержащих 0,7 % МПА в количестве 2,5 мл, расплавляют его на водяной бане и охлаждают до 45-50⁰ С. Во все пробирки с МПА вносят 0,1 мл 1 млрд взвеси эталонной суточной культуры и в каждую из пробирок добавляют по 1 мл одного из разведений – 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 испытуемого фага, перемешивают и добавляют во все пробирки по 2,5 мл 0,7 % МПА, охлажденного до 50^О С. Содержимое пробирок перемешивают и из каждой пробирки смесь вносят вторым слоем в соответствующую чашку с МПА по принципу одна пробирка – одна чашка. Смесь равномерно распределяют по поверхности агара в чашке и оставляют на 50 мин до полного охлаждения агара. Затем чашку слегка подсушивают и инкубируют при 37⁰ С в течение 18-20 ч.

На фоне равномерного роста бактерий отмечают пятна, где рост бактерий отсутствует, что обусловлено лизисом микробной культуры в результате действия бактериофага. При большом количестве бактериофага наступает лизис по всей поверхности агара, при меньших разведениях бактериофага наблюдаются отдельные зоны просветлений, в последней чашке (10^-8) зоны просветления отсутствуют. При определенном допуске, что каждый участок лизиса образован в результате действия одной частицы фага, то можно подсчитать в 1 мл препарата количество активных частиц фага. Допустим, что имеется 30 фаговых пятен, при разведении 10^-7 степени. Следовательно, титр фага равен 3х10^-8, т.е. в 1 мл фага содержится 3х10⁸ активных корпускул фага.

3. Титрование фага на твердых средах.

Растирают шпателем 1-2 капли молодой агаровой культуры по всей поверхности агара, дают подсохнуть и на разные сектора чашки наносят по 1 капле разных разведений фага, который исследуют. Предварительно, со стороны дна чашки маркируют сектора с фагом. После 18-24 ч инкубирования в термостате следует определять результаты. Титром считают максимальное разведение фага, которое вызвало полный лизис бактерий на данном секторе среды. Метод можно проводить параллельно с исследованием Аппельмана.

Метод выделения бактериофагов

Для выделения бактериофагов из объектов внешней среды готовят фильтрат исходного материала, для чего 3-5 г фекалий размешивают в 50 мл МПБ и инкубируют полученную взвесь при 37⁰ С в течение 18-20 ч. Далее взвесь очищают от взвешенных частиц, путем фильтрования. Освобождение фага от бактерий достигается за счет фильтрования через свечи или асбестовые пластинки. Корпускулы бактериофагов проходят через такой фильтр и обнаруживаются в фильтрате.

Метод фаготипирования бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Делят площадь чашки на квадраты (карандашом на дне чашки) и подписывают бактериофаг, который с помощью пастерки наносят на квадрат по одной капле. После инкубации 18-24 ч отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий.

Фаготип культуры определяется тем типом фага, который вызвал лизис данного штамма.

Специфичность бактериофагов определяют методами Отто и Фюрта.

1. Метод Отто. Растопленный 3 % мясо-пептонный агар разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают в термостате 10-15 мин. Газоном засевают на чашки 16-18 ч бульонную культуру разных бактерий. Наносят каплю известного фага ближе к одной из сторон чашки, затем чашку наклоняют и дают капле фага стечь до противоположного края чашки. Чашки инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч и затем учитывают результат. Если фаг гомологичен бактериям в определенной чашке и биологически активен, то по пути стекания капли фага роста бактерий в этой чашке не будет, среда останется прозрачной.

2. Метод Фюрта. В 15-30 мл МПБ вносят 0,5 мл фекалий и помещают в термостат при 37⁰ С на 24 ч. На другой день МПБ фильтруют через свечу и полученный фильтрат заливают 1,5 % МПА, охлажденным до 50⁰ С. Фильтрат тщательно смешивают с агаром и заливают в чашку Петри, когда агар остынет, подсушивают в термостате.

Дно чашки делят на 8-10 секторов и на каждый из них засевают штрихом бульонную культуру бактерий 3 ч возраста. Чашки ставият в термостат на 37^о С. Результат учитывают через 18-24 ч экспозиции при 37^о С. Если в исследуемом фильтрате есть бактериофаг, то гомологичный микроорганизм на среде расти не будет или только путем отдельных колоний. На секторах, куда засеяли бактерии гетерогенные бактериофагу, будет нормальный рост микробов.

По модификации Фишера, дно чашки делят пересекающимися линиями на тридцать квадратов. В центр каждого квадрата вносят исследуемые бульонные культуры. Результат учитывают через 18-24 ч инкубирования в термостате.

Экология микроорганизмов

Микробиологическую оценку санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды проводят в бактериологических лабораториях ЦГСЭН с помощью методов санитарной микробиологии.

Целью санитарно-микробиологических обследований объектов внешней среды является установление их эпидемической безопасности. Для этого применяют методы определения общей микробной обсемененности, обнаружения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов (таблица № 13).

О микробной обсемененности судят по общему количеству микробов в единице или площади (1 см³ воды, 1 г почвы и т.д.).

Санитарно-показательная флора - это представители облигатной флоры кишечника и органов дыхания организма человека и животных. Они постоянно выделяются в процессе жизнедеятельности человека и животных с фекалиями или капельками слизи из воздушно-дыхательных путей. Они способны длительно сохраняться на объектах внешней среды при неспособности интенсивного размножения вне организма хозяина.

Таблица № 13.

Объект	Характер загрязнения	Санитарно-показательные микроорганизмы
Вода	фекальное	кишечная группа бактерий
Почва	промышленно-бытовые отходы	те же и клостридии
Пищевые продукты	фекальное, воздушно-капельное	кишечная группа бактерий, S.aureus
Предметы обихода	фекальное	кишечная гр. бактерий, S.faecalis, S.aureus
Воздух	воздушно-капельное	S.aureus, S. pyogenes.

О микробной обсемененности судят по общему количеству микробов в единице или площади (1 см³ воды, 1 г почвы и т.д.).

Санитарно-показательная флора - это представители облигатной флоры кишечника и органов дыхания организма человека и животных. Они постоянно выделяются в процессе жизнедеятельности человека и животных с фекалиями или капельками слизи из воздушно-дыхательных путей. Они способны длительно сохраняться на объектах внешней среды при неспособности интенсивного размножения вне организма хозяина.

Например, обнаружение E.coli на объектах внешней среды следует считать достоверным показателем фекальных загрязнений. Находки Closridium cвидетельствуют о возможно более давнем их фекальном загрязнении. Находки S.pyogenes могут cвидетельствовать о воздушно-капельном загрязнении, например, воздуха.

Микрофлора воды. Для отбора проб питьевой воды используют посуду или емкость, специально предназначенную одноразовую, приготовленную из материала не влияющего на жизнеспособность микробов. Посуда оснащена плотно закрывающимися пробкой и сверху защитным колпачком (фольга, плотная бумага).

Посуда открывается непосредственно перед отбором воды, удаляя пробку с колпачком. Ополаскивать посуду запрещено. Если отбор идет из крана, то его вначале обжигают, затем его полностью открывают и выпускают воду 10 мин. При отборе напор воды может быть уменьшен. Пробу воды отбирают непосредственно из крана.

При отборе воды при постоянном ее изливе через кран, обжигание не делают, а забор ведут с помощью силиконовых или резиновых шлангов. При наполнении емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. Доставляют воду в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10⁰ С. Исследования проводятся не позднее 6 ч от забора воды.

1. Фильтрационый метод исследования воды. В верхнюю часть подготовленного фильтровального аппарата наливают точно отмеренное количество воды (водопроводная вода - 3 фильтра по 100 мл или 300 мл сразу на один фильтр). В нижней части этого прибора создают вакуум. После окончания фильтрования проб воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают пинцетом за край и переносят не переворачивая на питательную среду Эндо в чашку Петри, избегая возникновения пузырьков воздуха между двумя поверхностями. На дне чашки делают надписи. Чашки ставят в термостат дном вверх и инкубируют при 37⁰ С в течение 24 ч.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах не выросли колонии. Наличие типичного роста указывает на положительный результат и подсчитывают число колоний темно-красных, красных с металлическим блеском, с красным центром и отдельно розовых (лактозоотрицательные) колоний. Отбирают по 5 колоний каждого типа и пересевают на скошенный агар, инку