Приготовление фиксированного мазка

Список практических навыков

Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки. Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько 3 раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом (спиртами, смесью Никифорова и т.д.).

Окраска фиксированного мазка простым методом

Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему остыть и наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин. Затем смывают водой и высушивают препарат фильтровальной бумагой.

3. Окраска фиксированного мазка по методу Грама:

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель - генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.

2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.

4. Промыть водой.

5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.

6. Промыть водой, высушить.

4. Питательные среды:

Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.

Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.

Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.

Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.

Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда ЖСА (желточно-солевой агар)- плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.

Состав: МПА - питательная основа; 10%NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.

Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.

Серологические реакции

Титрованне агглютинирующей сыворотки

Тип реакции: реакция агглютинации.

Исследуемый материал: сыворотка животного, гипериммунизированного бактериальной взвесью.

Диагоностический препарат: взвесь убитых бактерий, применявшихся для гипериммунизации.

Принцип метода: к серийным разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют равные количества взвеси убитых бактерий, применявшихся для получения этой сыворотки.

Положительный результат реакции: образование хлопьев, просветление жидкости. Отрицательный результат: равномерная муть. Применение: для определения титра агглютинирующей сыворотки.

Титр агглютинирующей сыворотки -наибольшее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается агглютинация. В данном случае титр агглютинирующей сыворотки равен ...

Реакция флоккуляции

Тип реакции: частный случай реакции преципитации (нейтрализации).

Исследуемый материал: антитоксическая сыворотка.

Диагностический препарат: токсин или анатоксин в строго определенном количестве.

Принцип метода: к серийным разведениям антитоксической сыворотки добавляют одинаковое количество антигенных единиц токсина или анатоксина.

Положительный результат - образование хлопьев преципитата (флоккулята); отрицательный результат - прозрачная жидкость.

Применение: определение активности антитоксической сыворотки (количества ME - международных единиц в 1 мл сыворотки).

Трактовка результатов: первичная (инициальная) флоккуляция наступает в пробирке, где АГ (антиген) и АТ (антитело), находятся в эквивалентных количествах. Зная количества ингредиентов в пробирке, где произошла инициальная флоккуляция, можно рассчитать активности антитоксической сыворотки. Например, инициальная флоккуляция наступила в пробирке, где находится 0,02 мл сыворотки и 4 АЕ (антигенных единиц) токсина или анатоксина. Составляем пропорцию: 0,02 мл сыворотки эквивалентно 4 АЕ токсина или анатоксина.

Одна АЕ - это такое количество токсина или анатоксина, которое связывается одной ME антитоксической сыворотки, следовательно, 0,02 мл данной сыворотки содержит 4 ME.

Титр антитоксической сыворотки - это количество ME в 1 мл этой сыворотки.

В данном случае, составив пропорцию, можно определить титр:

0,02 мл - 4 ME

1 мл - ХМЕ

Х = (1x4): 0,02 = 200 ME

В данном случае...(результат и расчет).

Титрование комплемента

Тип реакции - реакция иммунного гемолиза.

Исследуемый материал - свежая сыворотка крови.

Дополнительные ингредиенты реакции: гемолитическая система (гемолитическая сыворотка в рабочей дозе и 3% взвесь эритроцитов барана).

Положительная реакция - гемолиз; отрицательная - задержка гемолиза.

Титр комплемента - наибольшее разведение комплемента, в котором наблюдается гемолиз.

Применение: для определения титра комплемента. Если речь идет о титровании комплемента перед постановкой РСК, то титр определяют для дальнейшего расчета рабочей дозы. Используется разведение на 25% концентрированнее, чем титр.

В данном случае...(результат).

Список практических навыков

Приготовление фиксированного мазка