Вирусологическое исследование
Индикация вируса
Вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вируса осуществляется в организме животного, куриного эмбриона или в культуре ткани
Культивирование вируса в организме животных. Чаще всего этот метод используют для выделения вирусов, не способных вызывать цитопатическое действие в культуре клеток и не способных размножаться в куриных эмбрионах (некоторые арбовирусы, вирус бешенства, вирусы ящура, вирусы Коксаки, вирусы лимфоцитарного хориоменингита). Исследуемый материал вносят в организм с учетом тропизма вируса к определенным тканям.
Культивирование в куриных эмбрионах. В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке размножаются многие патогенные вирусы. При культивировании учитывается тропность вируса к определенной ткани. Для исследования берут аллантоисную жидкость; ее отсасывают пипеткой после прокола хорион-аллантоисной оболочки. Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкости зараженного эмбриона определяют в иммунологических реакциях.
Культивирование в культуре ткани. В настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Источником получения клеток служат ткани эмбрионов, а также ткани, извлеченные у человека при операции. Чаще всего применяют культуры клеток, полученных из нормальных и раковых тканей организма. Широко используют линии клеток Hela, полученные из опухолей шейки матки; Hep-2, полученные из злокачественной опухоли гортани; КВ – из ткани рака полости рта. После культивирования в культуре ткани, индикацию наличия вируса проводят по выявлению специфической дегенерации клеток. Для этого зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и регистрируют цитопатическое действие вируса на клетку, которое может проявиться в образовании многоядерных гигантских клеток и симпластов; дегенерации клеток и развитии очагов клеточной пролиферации, а также в образовании внутриклеточных включений в цитоплазме или ядре пораженных клеток или по цветной пробе (наличию или отсутствию роста в чувствительных тест-системах).
Первичные культуры клеток – это однослойные культуры, которые способны размножаться только в первичной генерации. Для получения первичных культур используют исходный материал: эмбриональные или зрелые ткани животных.
Культуры полуперививаемых клеток– получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Клетки полуперевиваемых культур быстро размножаются, выживают до месяца, при ежедневной смене среды. Высокочувствительны ко многим вирусам.
Культуры перевиваемых клеток– это культуры клеток, способные бесконечно долго размножаться вне организма при культивировании. При длительных пассажах их исходные свойства могут изменяться. Для сохранения исходных свойств маточную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, ежедневно пассируя.
Индикация вируса по цитопатическому (ЦПД) действию.ЦПД – это совокупность морфологических и функциональных изменений, происходящих в клетке под влиянием внутриклеточного вируса, приводящих к нарушению метаболизм клеток, прекращению синтеза НК, подавлению синтеза белка. Происходит освобождение и активация клеточных лизосомальных ферментов, которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, то есть развитие ЦПД, что выражается в симпластообразовании, образовании включений, пикнозе ядра.
Индикация вируса по ЦПД. Проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур (монослой клеток). Для этого просматривают под малым увеличением микроскопа сплошной клеточный слой. Культуральную жидкость осторожно отсасывают пипеткой и вносят по 0,1 мл исследуемого материала в пробирку и добавляют питательную среду до 1 мл. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными. Пробирки выдерживают в термостате при 370С и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД.
Индикация вируса в реакции гемадсорбции. Гемадсорбция – это способность культуры клеток, которая заражена вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Этот феномен связан со способностью встраиваться в мембрану зараженных вирусом клеток вирусспецифических белков-гемагглютининов, к которым присоединяются эритроциты за счет специальных рецепторов и адсорбируются на поверхности зараженных клеток.
Индикация вируса по цветной пробе. Цветная проба основана на регистрации изменения цвета среды, которая содержит фенолрот (индикатор) и помещенный в нее исследуемый материал. Если в материале есть вирус, он разрушает клетки монослоя и они становятся неспособнымы к метаболизму. Собственных систем метаболизма вирус не имеет, следовательно, кислых продуктов метаболизма не выделяет, и цвет питательной среды не меняется. Если в материале нет вируса, то клетки монослоя живут, функционируют, выделяют кислые продукты метаболизма, что приводит к изменению цвета среды, она приобретает желтый цвет.
Идентификация вируса
Идентификацию вируса до уровня семейства проводят с помощью следующих тестов:
1. Определение типа нуклеиновой кислоты вириона. Интерпретацию результатов проводится по цветной пробе, то есть по наличию или отсутствию роста в чувствительных тест-системах. Размножение ДНК-содержащих вирусов ингибируется бромдезоксиуридином, в то время как РНК-содержащие вирусы нечувствительны к этому реактиву.
2. Определение наличия суперкапсидной оболочки..Вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, содержат липиды и поэтому чувствительны к обработке эфиром. При последующем испытании биологической активности они теряют свою инфекционность.
3.Определение размеров вириона. Размер вириона определяют по способности вируса проходить через поры мембранных фильтров известного диаметра. До и после фильтрации проверяют инфекционность исследуемого материала методом цветной пробы.
4.Определение наличия или отсутствия гемагглютинина. Некоторые вирусы обладают гемагглютинирующей активностью. Ее учитывают в реакции гемагглютинации.
5.Идентификацию вируса до вида, внутривидовую идентификацию чаще всего проводят в реакции вируснейтрализации с соответствующими сыворотками.
6.Учет результатов реакции проводится в зависимости от биологии вируса:по результатам РТГА; по цветной пробе; по отсутствию цитопатического действия; по выживаемости чувствительных животных;
- по отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.
МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ