Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

a. классификация спирохет

b. морфологические особенности возбудителей сифилиса, возвратного тифа и лептоспирозов

c. ультраструктура спирохет

d. методы исследования спирохет

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение Treponema pallidum в мазке из отделяемого твердого шанкра, окраска по Романовскому-Гимзе (зарисовать)

2. Изучение спирохеты зубного налета, окраска по Боголепову (зарисовать)

3. Изучение мазка из зубного налета окраска по Боголепову (зарисовать)

4. Изучение Borrelia recurrentis в мазке крови, окрашенном по Романовскому-Гимзе (зарисовать)

Изучение устройства темнопольной микроскопии

5. Подведение итогов занятия – 5 минут

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА. Риккетсии, хламидии, вирусы. Классификация, морфология, ультраструктура. Физиология риккетсии, хламидии, вирусов. Типы культуры ткани.

Цель занятия. Ознакомить студентов с морфологией и ультраструктурой риккетсий. Дать понятие о вирусах как облигатных внутриклеточных паразитах, познакомиться с методами культивирования и индикации вирусов, охарактеризовать роль вирусов в патологии человека

Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин.

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин.

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин.

a. Положение риккетсий в системе живых организмов

b. Строение и химический состав риккетсий

c. Методы изучения риккетсий

d. Методы культивирования риккетсий

e. Общая характеристика вирусов, их место в биосфере.

f. Основные принципы современной классификации вирусов

g. Структура и химический состав вириона

h. Методы изучения размеров и морфологии вирусов

i. Взаимодействие вирусов с клеткой

j. Понятие о внутриклеточных включениях

k. Культивирование вирусов

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение риккетсии Провачека, окрашенные фуксином с подогреванием (зарисовать)

Риккетсии, в отличие от бактерий, плохо окрашиваются обычными анилиновыми красителями, поэтому для их окраски используют методы, основанные на протравливании или метод Романовского-Гимзы. В нашей стране чаще всего пользуются окраской по Здродовскому, который, в связи с наличием в клетке риккетсий большого количества липидов, рекомендует окрашивать препарат карболовым фуксином, с последующим обесцвечиванием слабым раствором органической кислоты и докрашиванием водным раствором метиленовой синей. При этом риккетсии окрашиваются в рубиново-красный, протоплазма клеток – в голубой, а ядра ̶ в синий цвет.

Метод Здродовского удобен для окрашивания риккетсий, находящихся внутриклеточно. Чистую культуру можно окрасить карболовым фуксином с последующим прогреванием окрашиваемого препарата на огне. Риккетсии при этом окрашиваются в красный цвет.

2. Изучение риккетсии Цуцугамуши, окрашенные по Романовскому-Гимзе (зарисовать)

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура. Цитоплазма риккетсий окрашивается в голубой цвет с различными оттенками, ядерная субстанция – в красный, но ввиду малых размеров риккетсий эти цвета сливаются и воспринимаются как сиреневый.

3. Изучение морфологии вирусов (по электронным микрофотографиям)

Студенты изучают строение некоторых вирусов, обращают внимание на структуру и тип симметрии нуклеокапсида строение капсомеров, знакомятся с морфологией сложноустроенных вирусов. Микрофотографии зарисовывают в тетради.

4. Тельца Пашена (зарисовать)

Вирус оспы был выявлен в обычном световом микроскопе Пашеном. Обнаружение вируса в содержимом везикул является быстрым методом диагностики, применяется в раннем периоде болезни.

Для обнаружения вирусов оспы используют специальные методы окраски. Наиболее эффективным из них является метод серебрения по Морозову. Этот метод, основанный на протравливании и дополнительной импрегнации серебром, позволяет искусственно увеличивать вирус до размеров 0,2 мкм. Вирус оспы окрашивается в черный цвет. Частицы вируса имеют вид округлых образований, располагающихся по одиночке или небольшими скоплениями на светло-коричневом фоне детрита.

5. Тельца Гварниери (зарисовать)

Тельца Гварниери обнаруживаются в пораженных эпителиальных клетках при оспе. Они имеют шаровидную или серповидную форму, размер от 1–4 до 10 мкм. При окраске по Романовскому-Гимзе тельца Гварниери имеют сиреневато-розовый или ярко-красный цвет, плотную или зернистую консистенцию и окружены светлым реактивным ободком, располагаются в цитоплазме.

6. Тельца Бабеша-Негри (зарисовать)

Специфические внутриклеточные включения Бабеша-Негри обнаруживаются при бешенстве в нейронах аммонова рога, а также в клетках мозжечка, продолговатого мозга. Для окраски готовят гистологические срезы, мазки-отпечатки и обычные мазки, окрашивают по методу Туревича, Муромцева, Романовского-Гимзы. Тельца Бабеша-Негри представляют собой круглые или вытянутые образования, размером 0,25–0,28 мкм, уплотненные в центре с зернистой периферической частью. В одной клетке их может быть несколько. По Муромцеву цитоплазма окрашивается в бледно-голубой цвет, ядра клеток – в синий, а тельца Бабеша-Негри – в бледно-фиолетовый.

7. Заражение куриных эмбрионов (знакомство по схеме). Составить схему. Оформить протокол

Для вирусологических исследований используют оплодотворенные яйца 7–12-дневного возраста. Отбирают крупные, чистые (но немытые) оплодотворенные яйца, предпочтительно белых кур, хранившиеся не более 10 дней при 5–10°С. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятна. При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения куриного эмбриона. Перед заражением определяют на овоскопе жизнеспособность эмбриона. Живые эмбрионы подвижны, видна пульсация сосудов. Простым карандашом отмечают границы воздушной полости и место расположения эмбриона. Заражение проводят в асептических условиях, инструментами, простерилизованными кипячением.

Подготовка яиц. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, которые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона (при овоскопии), карандашом отмечают место заражения. Скорлупу перед заражением обрабатывают 70% спиртом, обжигают на пламени, а затем дезинфицируют 2% раствором йода.

Заражение в хорионаллантоисную полость. Специальным стилетом прокалывают скорлупу сбоку и над воздушной камерой, после чего шприцем вводят 0,1–0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2–3 мм ниже границы воздушной камеры. Оба прокола в скорлупе заливают расплавленным стерильным парафином. В зависимости от типа вируса куриные эмбрионы инкубируют 48–72час.

Заражение в хорионаллантоисную оболочку. Изогнутыми ножницами удаляют продезинфицированную скорлупу выше границы воздушной полости. Пинцетом удаляют часть подскорлупной оболочки, обнажая хорионаллантоисную оболочку, инфекционный материал наносят в объеме 0,1–0,2 мл (в материал для подавления бактериальной флоры добавляют 400 ед. пенициллина и 0,4 мг стрептомицина на 1 мл). Целостность скорлупы восстанавливают путем наложения стеклянного стерильного колпачка. Зараженные эмбрионы помещают в термостат и инкубируют в зависимости от типа вируса 48–72 час.

Заражение в полость амниона. Скорлупу яйца над воздушной камерой разрезают ножницами и через образовавшееся окно радиусом 1–1,5 см осторожно отслаивают глазным пинцетом подскорлупную оболочку. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки делают прокол глазным пинцетом и продвигают его к эмбриону. Затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку и осторожно вытягивают часть наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. Извлеченный эмбрион перехватывают широким пинцетом, который держат в левой руке. Затем шприцем с иглой вводят в вытянутый амниотический мешок 0,1–0,2 мл исследуемого материала. После заражения пинцет разжимают, и амнион погружается в аллантоисную полость. Окно в скорлупе закрывают стеклянным колпачком, края которого заливают стерильным парафином. Яйцо помещают в штатив тупым концом вверх.

Заражение в желточный мешок. Скорлупу прокалывают по центру воздушной камеры и через образовавшееся отверстие при помощи туберкулинового шприца с иглой № 21 длиной 3,8 см вводят 0,2–0,5 мл испытуемого материала в желточный мешок. Для этого иглу вводят вертикально до упора, затем ее быстро вынимают и отверстие заливают парафином. Яйца в вертикальном положении инкубируют 48 ч при 37˚С.

Вскрытие куриных эмбрионов. Вскрытие производят в боксе с соблюдением правил асептики. Перед вскрытием скорлупу дезинфицируют таким же способом, как и при заражении. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе прикрепления хорионаллантоисной оболочки. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, пастеровской пипеткой прорывают хорионаллантоисную оболочку в месте, лишенном крупных кровеносных сосудов (прорывать осторожно, не повреждая сосудов, в случае кровоизлияния вирус адсорбируется на эритроцитах и биологическая активность аллантоисной жидкости снижается). От одного зараженного эмбриона можно собрать 6–10 мл аллантоисной жидкости. Собранную жидкость контролируют на стерильность путем посева 0,1–0,2 мл в сахарный бульон, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинации.

8. Постановка ориентировочной реакцией гемагглютинации (РГА) (знакомство по схеме). Зарисовать схему постановки ориентировочной РГА. Оформить протокол

Реакция гемагглютинации широко применяется в вирусологии для обнаружения вирусов и их титра в исследуемом материале. Ориентировочная РГА ставится капельным методом на стекле. На чистое обезжиренное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов курицы и каплю испытуемого материала, тщательно перемешивают пастеровской пипеткой. При положительном результате через 1-2 минуты наблюдается появление агглютинации эритроцитов.

9. Постановка реакции гемагглютинации (знакомство по схеме). Зарисовать схему постановки развернутой РГА. Определить по схеме (таблица 1) количество вируса. Оформить протокол

Развернутая РГА осуществляется на плексигласовых пластинах с лунками, в которых готовят двукратные разведения вируссодержащего материала. Затем добавляют взвесь эритроцитов и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

При гемагглютинации осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии феномена эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

Таблица 1