Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий
Выделение чистых культур анаэробов изучаем на примере выделения C.perfringensиз раневого отделяемого при подозрении на газовую гангрену.
1-й этап. Обогащение на среде Китта–Тароци.
1.Приготовление мазков из раневого отделяемого и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки, часть которых окружены неокрасившейся капсулой (в виде белого ободка), что позволяет заподозрить газовую инфекцию.
2.Посев раневого отделяемого на среду Китта-Тароцци, предварительно прокипяченной в течении 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются;
3.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
2-й этап. Получение изолированных колоний.
1.Изучение характера роста на среде Китта-Тароцци. При росте C.perfringensона мутнеет и в ней образуется газ (результат образования газа при ферментации глюкозы).
2.Приготовление мазка из бульонной культуры и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки.
3.Получение изолированных колоний анаэробов двумя способами:
- на поверхности твердой питательной среды (сахарно-кровяного агара) по Цейсслерув анаэробных условиях;
- в глубине среды Вильсон-Блера по Вейнбергу.
4.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
3-й этап. Выделение чистой культуры.
1.Макроскопическое изучение выросших колоний анаэробов:
а) на сахарно-кровяном агаре, обратить внимание на зону гемолиза вокруг колоний, что является признаком гемолитической активности бактерий (вирулентности);
б) в глубине среды Вильсон-Блера, обратить внимание на цвет колоний. Черные колонии образует C.perfringensза счет образования сульфата железа (FeS).
2.Приготовление из подозрительных колоний мазков и окрашивание их по Граму. Под микроскопом выявляются крупные грамположительные палочки;
3.Остаток колонии, подвергшейся микроскопическому изучению, отсевают на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры.
4.Инкубация посевов в термостате при 370 в течение 18-24 часов.
4-й этап.Идентификация выделенной чистой культуры анаэробов.
1.Макроскопическое определение роста культуры на среде Китта-Тароцци;
2. Проверка выделенной культуры на чистоту - приготовление мазков со среды Китта-Тароцци и окрашивание их по Грамму. Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально.
3.Окончательная идентификация выделенной чистой культуры анаэробов
проводится по токсигенности в реакции нейтрализации экзотоксина на белых мышах, биохимическим, антигенным свойствам и по генетической структуре.
5-й этап.Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.
Например, выделена чистая культура C.perfringens, идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам и по генетической структуре.
Вирусологические методы
Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.
Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полостьс целью
выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.
1-й этап.Выделение вируса (культивирование вируса).
Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.
Ход работы:
1) перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;
2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;
3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;
4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;
5) Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;
6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;
7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 370 С.
2-й этап.Идентификация выделенной чистой культуры вируса.
Ход работы:
1) яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;
2) обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;
3) осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;
4) идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.
Компоненты реакции:
1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);
2) 5% суспензия куриных эритроцитов;
3) физиологический раствор.
Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.
Капельный способ на стекле:
Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.
Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.
Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).