Соблюдение правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

По дисциплине «Микробиология, вирусология»

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Уфа – 2016

УДК 579 (075.8)

ББК 52.6Я7

П 69

Рецензенты: Телешева Л.Ф.,проректор по научной работе, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» МЗ РФ, д.м.н.:

Чайникова И.Н, ведущий научный сотрудник Лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, д.м.н., профессор.

«Практические навыки» по дисциплине «микробиология, вирусология»: учебное пособие /соавт.: Г.К.Давлетшина,, М.М.Туйгунов, Ю.З.Габидуллин, А.А.Ахтариева, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, - Уфа:изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава РФ, 2016 . - 84 с.

Учебное пособие подготовлено на основании рабочей программы по дисциплине «микробиология, вирусология» (2016г.), действующего учебного плана ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава РФ (2016г.) и в соответствии с требованиями. ФГОС ВО по специальностям: 31.05.01 - лечебное дело и 31.05.02. – педиатрия.

Издание предназначено для самостоятельной аудиторной работы студентов лечебного и педиатрического факультетов. В пособии излагаются основные практические навыки по дисциплине «микробиология, вирусология», приведены основные принципы и этапы постановки микробиологических методов.

УДК 579 (075.8)

ББК 52.6Я7

© Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ МЗ РФ

Содержание

ВВЕДЕНИЕ. 6

1. СОБЛЮДЕНИЕ ПРАВИЛ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОГО РЕЖИМА И ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ.. 8

1.1 Основные правила поведения в бактериологической лаборатории. 8

1.2 Правила забора материала для микробиологических исследований. 9

1.3 Правила забора материала, хранения и транспортировки при особо опасных инфекциях (ООИ) 10

1.4 Оформление направления на микробиологическое исследование. 11

1.5. Дезинфекция в микробиологической лаборатории: рук, рабочего места, выделений больного, предметных и покровных стекол. 11

1.6 Стерилизация лабораторной посуды, подготовка к стерилизации. 12

2. ОВЛАДЕНИЕ НАВЫКАМИ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ И ТИНКТОРИАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ МИКРООРГАНИЗМОВ.. 13

2.1 Этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии. 13

2.2 Овладение методикой микроскопирования с иммерсионной системой. 14

2.3 Сложные методы окраски: методы Грама, Циля- Нильсена, Нейссера и Бурри-Гинса 16

2.4 Методы определения подвижности бактерий. 19

3. ОВЛАДЕНИЕ НАВЫКАМИ ИЗУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ, БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И ФАГОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ 21

3.1 Механические и биологические методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных бактерий. 21

3.2 Метод Дригальского. 23

3.3 Методы создания анаэробных условий. 27

(механические, физические, химические и биологический) 27

3.4 Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий. 28

3.5 Вирусологические методы.. 30

3.6 Реакция гемагглютинации (РГА) 32

3.7 Методы индикации бактериофагов (качественные и количественные методы) 33

3.8 Реакция фаголизиса. 35

3.9 Реакция фаготипирования S.aureus. 35

4. ОВЛАДЕНИЕ НАВЫКАМИ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЕ. 36

4.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 36

4.2 Метод рекомбинации. 37

5. ОСВОЕНИЕ ПРИНЦИПОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СТЕРИЛИЗАЦИИ И НАВЫКОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТКОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ.. 38

5.1 Контроль эффективности физического способа стерилизации (кипячение) бактериологическим методом. 38

5.2 Определение антибиотикочусвтвительности бактерий методами «бумажных дисков» и серийных разведений. 39

6. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА 41

7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА (МЕТОД КОХА) И САНИТАРНО - ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ ВОЗДУХА.. 43

8. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД И МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ.. 44

8.1 Заражение экспериментальных животных (биологический метод) 44

8.2 Методы определения факторов вирулентности микроорганизмов (адгезивности, ферментов агрессии бактерий: гиалуронидазы, лецитовителлазы, лизоцима; токсигенности, гемолизинов) 47

8.3 Методы определения персистентных свойств бактерий: капсулообразования, антигенов-ингибиторов фагоцитоза, антилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активностей. 49

9. ИММУНОЛОГИЧЕКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И СЕРОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.. 52

9.1 Реакция агглютинации (РА) на стекле. 52

9.2 Развернутые реакции агглютинации Видаля, Вейгля и Райта. 53

9.3 РПГА – реакция пассивной гемагглютинации (определение напряженности поствакцинального противодифтерийного и противоскарлатинозного антитоксических иммунитетов) 55

9.4 Реакция преципитации (РП): термопреципитации по Асколи и РП в геле по Оухтерлони. 57

9.5 Идентификация Сl.рerfringens по токсигенности в реакции нейтрализации токсина антитоксином (РН) на мышах. 59

9.6 Идентификация вируса клещевого энцефалита в реакции нейтрализации вирусов (РН) на мышах. 59

9.7 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (определение серотипа вируса гриппа А) 60

9.8 Реакции связывания комплемена: РСК Борде-Жангу, РСК, 61

Вассермана, РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемы.. 61

9.10 Реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ) (экспресс-диагностика и серологическая диагностика гриппа А) 66

9.11 Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ - инфекции) 68

9.12 Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции с помощью реакции иммуноблоттинга 71

РИСУНКИ.. 73

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.. 82

Коллектив авторов. 84

ВВЕДЕНИЕ

Микробиология, вирусология находится на стыке фундаментальных и теоретических дисциплин, поэтому знание этих дисциплин необходимо каждому врачу и медицинскому работнику независимо от его ведущей специальности. Полученные при изучении дисциплин теоретические знания и практические умения позволят обучающимся воспользоваться результатами микробиологических исследований для подтверждения клинического диагноза на старших курсах и проведения лечения с учетом антибиотикочувствительности возбудителей инфекционных заболеваний.

Цель учебного пособия – освоение студентами практических навыков по микробиологической диагностике инфекционных и оппортунистических болезней человека и дать представление о методологических подходах к оценке их результатов.

В результате изучения дисциплины обучающиеся должны знать основных методов микробиологической диагностики:

- микроскопический – изучение морфологии и тинкториальных признаков микробов;

- биологический – метод заражения лабораторных животных;

- бактериологический – получение чистых культур микробов и идентификация их, т.е. определение вида микроба;

- иммунологический (серологический) – это применение иммунологических реакций с целью идентификации микробов по антигенной структуре и определения антител против возбудителей;

- аллергический метод – выявление инфекционной аллергии;

- молекулярно-биологический метод – это метод идентификации микробов по генетической структуре.

Обучающиеся должны уметь:

- соблюдать технику безопасности;

- выполнить микробиологические исследования,

- применять схему микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

В пособии изложены практические навыки, ориентированые на конечную цель подготовки врачей в соответствии с квалификационными характеристиками, в соответствии с учебными целями и задачами практических занятий; приведены основные принципы и этапы постановки микробиологических методов, основная часть которых выполняются студентами под руководством преподавателя в рамках практических занятий. При выполнении практических занятий для решения многих задач студенты используют готовые препараты, посевы, «пестрые» ряды, серологические реакции и т.д. Это сокращает объем самостоятельной работы, но не отражается на смысловом содержании темы.

Предлагаемая форма изложения практических приемов позволяет легко ориентироваться в методах микробиологической диагностики и делает учебное пособие доступным для самостоятельной практической работы студентов. Преподаватели кафедры надеются, что издание данного учебного пособия заметно повысит интерес студентов к практическим занятиям. Приобретение практических навыков позволит студентам более эффективно освоить изучаемую дисциплину, успешно сдать экзамен и способствует формированию у обучающихся общекультурных (ОК) и профессиональных (ПК) компетенций:

- готовность к саморазвитию, самореализации, самообразованию, использованию творческого потенциала (ОК-1) ;

- готовность решать стандартные задачи профессиональной деятельности с использованием информации, медико-биологической терминологии (ОПК-1) ;

- способность выявлять у пациентов основные патологические симптомы и синдромы заболеваний (ПК-6).

Авторы понимают, что учебное пособие не лишено недостатков и заранее признательны за критические замечания.

Оформление направления на микробиологическое исследование

Направление на исследование является сопроводительным документом, который прилагается к инфекционному материалу, предназначенному для лабораторных исследований.

Составляется по следующей форме:

1) название материала;

2) учреждение, направляющее материал;

3) фамилия, имя, отчество больного;

4) возраст;

5) адрес обследуемого;

6) дата заболевания;

7) дата взятия материала;

8) предполагаемый клинический диагноз;

9) подпись врача, направляющего материал.

Поступивший в лабораторию инфекционный материал регистрируется в специальном журнале.

Пробирки

1. биологические – с крупным дном, неразвернутым краем;

2. центрифужные – сужены книзу, конической формы

3. преципитационные – очень узкие с внутренним диаметром 2-3мм

Стеклянные чашкиПетри для выращивания микроорганизмов на плотных питательных средах. Их изготавливают из прозрачного стекла, не имеющего камней, пузырей. Высота чашки 20-30мм, диаметр 60-200мм

Пипетки

1. градуированные должны соответствовать параметрам ГОСТа

2. пастеровские – стеклянные трубки диаметром 5-7мм, у которых один конец оттянут над пламенем горелки в виде капилляра

Специальная лабораторная посуда должна быть чистой и стерильной. Мытье производят ершами с мылом и содой. Новую посуду следует до мытья прокипятить в 1-2% растворе хлористоводородной кислоты. Сушат посуду в сушильном шкафу.

Сухую посуду закрывают и помещают в пеналы. В пробирки вставляют ватные пробки и заворачивают в пачки по 5–10штук. К чашкам Петри подбирают крышки и завертывают по одной или несколько штук.

Пипетки закрывают ваткой с того конца, который берут в руки. Готовые пипетки заворачивают в бумагу и укладывают в пеналы.

Стерилизация проводится в сухожаровом шкафу при температуре 180°С в течение 1 часа.

Окраска мазка по Граму

Метод Грама применяется для выявления грамположительных и грамотрицательных бактерий (рис.1).

Методика окраски:

Ход работы   ____________________   1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты.	Методические указания   ____________________   Генцианвиалет – основная краска.     Раствор Люголя - протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.   Спирт – обесцвечивающий фактор.   Водный фуксин – дополнительная краска.	Ориентировочные данные ___________________   Грамположительные бактерии (кокки) синефиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета.
2.Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту.
3.Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течении 30 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски.
4.Промывают водой.
5.Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течении 1-2 минут.
6.Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать комплекс генцианвиолета с йодом связана со свойствами многослойного пептидогликана. Обработка спиртом вызывает сужение пор пептидогликана и тем самым задерживает краску. Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются и окрашиваются фуксином в красный цвет вследствие меньшего содержания пептидогликана, у них наиболее выражен липополисахаридный слой.

Окраска по Нейссеру

Метод используется для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии (С. diphtheria). В отличие от других коринобактерий у возбудителей дифтерии зерна волютина распалагаются на концах палочек .Этот сложный метод окраски включает несколько этапов:

1) фиксированный мазок окрашивают ацетатом синьки Нейссера

( основная окраска) в течение 2-3 мин.

2) наносят раствора Люголя (протрава) на 10-30 секунд;

3) промывают препарат водой;

4)окрашивают везувином (дополнительная окраска) в теч. 0,5-1 мин.

5) промывают препарат водой, высушить и микроскопируют.

Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис.4).

Окраска по способу Ожешки

Метод Ожешки применяется для выявления спор. Этапы окраски:

1) на нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают на пламени спиртовки 2-3 минуты;

2) кислоту сливают, препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем ;

3) окрашивают по Циль-Нильсену.

Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы в синий (рис.5).

Микроскопические

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло. Сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Бактериологические

Метод Шукевича

Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Метод Дригальского

Цель метода: Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и их идентификации.

Исследуемыми материалами могут быть мокрота, гной, испражнение и др. в зависимости от локализации возбудителя инфекционного заболевания. Метод проводится в 4 этапа, при выделении гемокультуры – 5 этапов. Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий изучаем на примере выделения чистой культуры кишечной палочки (E coli) из ее смеси со стафилококком.

1-й этап.Получение изолированных колоний. Колонии – это размножившиеся особи одной бактериальной клетки, выросшие на поверхности твердой питательной среды в виде изолированного скопления.

Ход работы:

а) приготовление мазков из данной смеси микробов и окраска по Граму. Под микроскопом видны грамотрицательные кишечные палочки и грамположительные стафилококки ;

б) рассев смеси на чашку с МПА шпетелем (рис.10). Мы засеваем несколько измененным методом Дригальского. Вместо 3-х чашек с МПА берем одну. На поверхность питательной среды в чашке наносят петлёй каплю исследуемого материала в 3-х точках: первые две точки – ближе к стенке чашки, а третью точку – в центре, которую растирают прокаленным и охлажденным шпателем сначала в одном направлении, затем перпендикулярно в другом направлении (рис.11). Чашку надписывают (фамилия студента, номер группы, дата) и ставят в специальный цилиндр вверх дном, чтобы образующиеся капельки паров воды, попадающие на крышу, не стекали на поверхность среды и не размазывали посева;

Рис.11.

в) инкубация посева в термостате при 37⁰ в течение 18-24 часов.

2-й этап.Выделение чистой культуры, то есть культуры, содержащей одного вида бактерий.

Ход работы:

а) макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске, характеру поверхности и краев, консистенции, структуре и размеру.

Просматривают чашку (не открывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20-30 см. Видно, что посев смеси дал рост неоднородных колоний. Колонии стафилококка выпуклые, гладкие, блестящие, с ровным краем, размером 1-4 мм в диаметре, прозрачные, золотистые или белого цвета (рис.12). Колонии кишечной палочки слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватого цвета, с ровным краем и гладкой блестящей поверхностью, размером 2-3 мм в диаметре (рис.13).

Колонии можно просмотреть с помощью лупы или под микроскопом (при малом увеличении) при этом лучше видна разница в структуре колоний;

б) микроскопическое исследование колоний.

Выбирают изолированные колонии того и другого микроба, из части каждой колонии делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Убеждаются, что золотистого цвета колонии содержат стафилококки - кокки располагаются скоплениями, грамположительны (рис.14), а серого цвета колонии - кишечные палочки, беспорядочно расположенные, грамотрицательные (рис.15);

в) остатки колоний кишечной палочки и стафилококков пересевают в пробирки с косым агаром. К пробиркам прикрепляют этикетку с указанием даты посева, группы, фамилии студента;

г) инкубация посевов в термостате при 37⁰ в течение 18-24 часов.

3-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры.

Ход работы:

а) макроскопическое определение роста культуры на скошенном МПА. Стафилококк на скошенном агаре растет в виде прозрачного налета золотистого или белого цвета, кишечная палочка - в виде сочного, блестящего, полупрозрачного налёта серого цвета;

б) проверка чистоты культуры. Готовят мазок, окрашивают его по Граму и просматривают под микроскопом (не менее 10 полей зрения). Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально;

в) идентификация выделенной чистой культуры бактерий проводится по биохимическим, антигенным свойствам, фагочувствительности, токсигенности (вирулентности) и по генетической структуре.

Идентификация E.coli по биохимическим признакам:

а) идентификация по сахаролитической активности E.coli проводится по изменению короткого «пестрого» ряда, который включает в себя среды Гисса (МПБ, 0,5% углеводов: лактозы, сахарозы, глюкозы, мальтозы, маннита и индикатр Андреде-кислый фуксин; в каждую пробирку помещают « поплавок» - стеклянные трубочки, запаянные с одного конца для улавливания газа; покраснение среды является показателем образования кислоты при ферментации углеводов). Исследуемую культуру засевают на среды «пестрого» ряда и инкубируют при 37⁰ в теч. 18-24 часов. E.coli ферментирует всех углеводов короткого «пестрого» ряда до кислоты и газа, за исключением сахарозы (рис.16) и в отличие от других представителей семейства Enterobacteriaceae, например, возбудителей брюшного тифа и паратифов А и В: S. typhi, S.P.A и S.P.B. S. typhi ферментирует всех углеводов короткого «пестрого» ряда до кислоты за исключением сахарозы и лактозы (рис.17), паратифозные палочки - тех же углеводов, но с образованием кислоты и газа.

б) идентификация по протеолитической активности.

Разложение микробами белка сопровождается образованием индола, сероводорода, аммиака.

Реакция на сероводород.Исследуемую культуру засевают в МПБ, под пробкой укрепляют полоску бумаги, пропитанной ацетатом свинца. Почернение бумаги после инкубации при 37⁰ в течение 2-3 суток свидетельствует о наличии сероводорода. E.coli не образует сероводород в отличие от возбудителей брюшного тифа и паратифа В.

Проба на индол: Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2-3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлороводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание; при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо.

Идентификация стафилококков по биохимическим признакам:

а) определениекаталазной активности

На предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков O₂ свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы. Каталазной активностью обладают стафилококки в отличие от стрептокков;

б) определение плазмокоагулазной активности.Плазмокоагулаза – фермент S.aureus сворачивающий фибрин за счет активации предшествующего в плазме крови протромбина, тем самым, защищая бактерии от клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

В пробирку с цитратной плазмой вносят исследуемую культуру, помещают в термостат при (37 +/- 1) °С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. S.аureus обладает плазмокоагулазной активностью в отличие от других стафилококков.

4-й этап.Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.

Например, выделена чистая культура E.coli (S. аureus), идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам, токсигенности (вирулентности), фагочувствительности и по генетической структуре.

Вирусологические методы

Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.

Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полостьс целью

выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.

1-й этап.Выделение вируса (культивирование вируса).

Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.

Ход работы:

1) перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;

2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;

3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;

4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;

5) Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;

6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;

7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 37⁰ С.

2-й этап.Идентификация выделенной чистой культуры вируса.

Ход работы:

1) яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;

2) обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;

3) осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;

4) идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.

Компоненты реакции:

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);

2) 5% суспензия куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.

Капельный способ на стекле:

Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.

Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.

Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).

Реакция фаголизиса

Реакция фаголизиса применяется для идентификации выделенной чистой культуры бактерий по фагочувствительности. Реакцию ставят в двух пробирках: №1 (опыт) и №2 (контроль). Реакция фаголизиса изучаем на примере идентификации выделенной чистой культуры S.sonnei из испражнения при подозрении на дизентерию.

Компоненты	Опыт	Контроль
1. МПБ 2.Исследуемая дизентерийная культура (S.sonnei) 3. Монофаг S. sonnei	+ +   +	+ +   -

Посевы инкубируют в термостате 18-24 часов при 37⁰ С.

При наблюдении за посевами впервые часы бульон в пробирках слегка мутнеет вследствие размножения бактерий. В дальнейшем в контрольной пробирке (без бактериофага) помутнение усиливается; в пробирке с бактериофагом через 6 часов происходит просветление в результате лизиса бактерий. Учет реакции проводятся по просветлению МПБ в результате лизируещего действия монофага на бактерии.

Метод рекомбинации

Метод рекомбинации заключается в следующем: а) выделение ДНК из разных клеток и организмов; б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК; в) введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки; г) создание условий для экспрессии секреции продуктов, кодируемых генами.

Целевые гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из плазмид или хромосом с помощью ферментов – рестриктаз, способных резать ДНК по определенным связам или синтезируются химически. Полученный целевой ген с помощью лигаз сшивают с геном вектора (плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды – гибрид плазмиды с фагом). Рекомбинантная ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК, космида) встраивается в микробы (E. сoli, дрожжи, вирусы и др.) или животную клетку, которая приобретает новое свойство – способность продуцировать нужные вещества (НВs-АГ вируса гепатита В, антигенов ВИЧ (р24,gp41, gp120 и др.), альфа-интерферона и др.

ОСВОЕНИЕ ПРИНЦИПОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СТЕРИЛИЗАЦИИ И НАВЫКОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТКОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА (МЕТОД КОХА) И САНИТАРНО - ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ ВОЗДУХА

Для оценки санитарно-бактериологического состояния воздуха определяют следующих показателей: микробного числа воздуха (количество микробов в в 1м³ воздуха) методами осаждения по Коху и аспирации по Кротову, наличие зеленящего стрептококка путем посева воздуха на кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового (среда Гарро), для обнаружения S. aureus – на желточно-солевой агар, для обнаружения других патогенных бактерий – соответствующие элективные питательные среды.

Определение микробного числа воздуха методом Коха проводится в 2 этапа:

1 этап. Отбор пробы воздуха. Стерильные чашки Петри с МПА открывают в месте отбора проб воздуха и выдерживают в течение 10 мин, после чего закрывают и инкубируют при 37⁰С в течение 48 часов.

2 этап. Учет результатов. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь формулой Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100см² в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха:

Х – количество микробов в 1м³ воздуха

X = а – число колоний, выросших на чашке

в – площадь чашки Петри, равная ПR ²

Метод Кротова является более точным методом определения микробного числа воздуха с помощью специального прибора.

Реакция агглютинации (РА) на стекле.

РА на стекле - ориентировочная РА, наступающая в течении нескольких минут, применяется только с целью идентификации выделенной из организма больного чистой культуры бактерий по антигенной структуре.

В РА на предметном стекле, поставленной с целью идентификации возбудителя брюшного тифа по антигенной структуре участвуют 3 ингредиента:

1)выделенная чистая культура S.typhi на скошенном МПА? (корпускулярный АГ- агглютиноген);

2)диагностические видоспецифические антисыворотки с АТ-ми против S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B., полученные путем гипериммунизации кроликов соотвествующими бактериальными антигенами;

3)изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Паралелльно вставится три реакции на стекле:

а)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S.typhi + бактерии со скошенного агара;

б)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S. paratyphi A + бактерии со скошенного агара;

в)1 капля физ. раствора + 1 капля диагностической сыворотки против S. paratyphi В + бактерии со скошенного агара;

Хорошо перемешать. Наличие агглютинации (выпадение хлопьев белого цвета) указывает на присутствие соответствующего возбудителя, при отрицательной - наблюдается равномерное помутнение (рис.27). Агглютинация – это склеивание бактериальных клеток под влиянием специфических антител.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (определение серотипа вируса гриппа А)

РТГА относится к реакциям нейтрализации in vitro.

Механизм. У некоторых вирусов (например, вируса гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител – антигемагглютининов наблюдается ингибированные гемагглютинирующей активности вирусов (рис.32).

Компоненты.

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость куриного эмбриона;

2) диагностические противогриппозные сыворотки с антителами против серотипов вируса гриппа А: А(Н1N1), А(Н2N2), А(Н3N2 и др.;

3) 3,5% взвесь куриных эритроцитов – индикатор реакции;

4) физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной – выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

Опсоно-фагоцитарная реакция

Применяется для определения опсонинов – антител, стимулирующих фагоцитарную активность лейкоцитов, т.е. серодиагностики инфекций, например, бруцеллёза.

Усиление фагоцитоза происходит за счёт присоединения опсонинов с активными центрами (Fав – фрагмент) к детерминантам бактерий, а затем с помощью Fc – фрагментов к Fc – рецепторам фагоцитов. В нормальной сыворотке содержится небольшое количество опсонинов, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. В иммунной сыворотке опсонинов больше и их активность в меньшей степени зависит от комплемента.

Компоненты	Опыт	Контроль
Исследуемая сыворотка Нормальная сыворотка Суточная микробная культура (напр., стафилококковая) Фагоциты – взвесь нейтрофилов	+ - + +	- + + +

Инкубация при 37°С в течение 30 минут. Из каждой пробирки готовят мазки, окрашивают по Романовскому – Гимзе и считают под микроскопом количество микробов в 100 и более нейтрофилах, т.е. определяют фагоцитарный показатель.

Фагоцитарный показатель – количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом.

Опсонический индекс – фагоцитарный показатель иммунной (исследуемой) сыворотки / фагоцитарный показатель нормальной сыворотки.

Чем выше опсонический индекс (должен быть > 1), тем выше иммунитет.

Реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ) (экспресс-диагностика и серологическая диагностика гриппа А)

В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.

Они применяются:

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ - инфекции)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстра