Метод окраски по Бурри-Гинсу: назначение, техника, результат.
Метод окраски по Бурри-Гинсу: назначение, техника, результат.
Исп. для окраски капс. бактерий; Основан на том, что капсула не восприн. красители и ее выявл. негатив.контрастир. фона по Бурри.
Техника:
1.На серед. предмет.стекла наносят каплю черной туши и смеш. с каплей культуры капс. бакт. с помощью петли.
2.Краем др. предмет.стекла делаю мазок по типу кровяного=>сушат на возд. и фиксир. в пламени горелки.
3.Окраш. в теч. 5 мин р-ром карболового фуксина,развед. водой 1:3.
4.Промываю водой,высуш.,микроскопир. с иммерсией.
Рез-т: тело бактерии окраш. в красный цвет,неокраш. капсулы контраст. выдел. на темном фоне препарата.
Метод окраски по Циль-Нильсену: назначение, техника окраски, результат
Назначение: для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры, актиномицитов)
Техника:
1) фиксиров-й мазок покрыв-т полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогрев-т над пламенем горелки для появл-я паров, каждый раз подливая краситель.
2) бумагу сним-т и обесцвечив-т мазок в 5% р-ре Н2SO4 , затем промыв-т водой.
3) на мазок налив-т р-р метиленового синего на 3-5 мин.
4) препарат промыв-т водой, высушив-т, микроскопир-т с иммерсией.
Рез-т:микобактерии окраш-ся в красный цвет; споры – красного цвета.
Метод окраски по Нейсерру: назначение, техника, результат.
Исп. для выявл. зерен волютина.
Техника:
1.Фиксир. мазок окраш. уксуснокислой синей 1 мин, затем сливают краску.
2.Промывают водой и наливают р-р Люголя на 20-30 сек.
3.Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.
4. Промывают водой, высуш., микроскопир. с иммерсией.
Рез-т: тела бактерий окраш. в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.
Метод окраски по Граму: назначение, техника окраски, результат.
Назначение: раздел-е м/о на 2 группы – грам– и грам+
Техника:
1) на фиксиров-й мазок накладыв-т полоску фильтров-й бумаги и налив-т карболовый р-р генцианового фиолетового на 1-2 мин.
2) сним-т бумагу и, не промывая мазок водой, налив-т р-р Люголя на 1 мин.
3) обесцвечив-т преп-т в 96%-ном р-ре спирта в теч-е 1-2 мин.
4) промыв-т водой.
5) докрашив-т водным р-ром фуксина в теч-е 1-2 мин.
6) промыв-т водой, высушив-т, микроскопир-т с иммерсией.
Рез-т: грам+ – синего цвета , грам– – красного цвета.
Методы обнаружения жгутиков и подвижности бактерий.
1) Окраска жгутиков по Леффлеру.
Техника:
1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемеш. и высушивают.
2. Обрабат. препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного р-ра танина с 5 мл насыщ. водного р-ра сернокислого железа).
3.Промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докраш. фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Рез-т: жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет.
2)Окраска жгутиков по Морозову.
Техника:
Готовят три реактива:
а)1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;
б) 5 г таннина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды;
в)5 г кристаллического нитрата серебра (AgNO3), 100 мл дистиллированной воды.
1. Нефиксир. мазок помещ. в стакан с дистил. водой и фиксир. р-ром № 1, одну мин.
2. Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин.
3. Мазок промывают водой, окраш. р-ром № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин.
Рез-т:жгутики приобретают темный цвет.
3) Исследование подвижности:
а) Метод «раздавленная капля» - на середину предмет.стекла наносят каплю сут. культуры бактерий и накрывают ее предмет. стеклом так, чтобы жидкость не растеклась за его края и в нее не попадали пузырьки воздух.
б) Метод «висячая капля» каплю бактерий наносят на середину покров.стекла, наклад. на него спец. предмет. стекло с углублением, смазанным вокруг вазелином так, чтобы капля находилась в центре лунки, затем препарат осторожно переворачивают.
Рез-т: исслед. в тёмном поле микроскопа или фазовом контрасте на наличие подвижности.
Биохимическая идентификация бактерий: пит.среды, постановка, учет рез-ов.
Методы культивирования и пит.среды для анаэробов.
Условия культ-ния:
Анаэробы –пониж. содер. кислорода, облигатные- при его отсутствии( посев материала внутрь жидкой или полутверд.среды)
Первый день.
-Исслед. материал(прогр. на кипящей водяной бане в теч. 10-20 мин)засевают в пробирку со ср. Китта-Тароцци=> охладить до 30-37 С. При выделении споровых форм анаэробов засеянную среду вновь прогревают на водяной бане при 80 С в теч. 20 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий, затем инкубируют в терм. при 37 С.
Второй день.
Просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму. В положит.случае обнаруж. помутнение и пузырьки газа в среде и крупные споровые грамполож. палочки.
Для выделения чистой культуры по методу Цейслера петлю материала из среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и распределяют шпателем по поверхности среды, затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолир. колоний.
По методу Вейтберга одну или две петли материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным остуженным до 50 С сахарным мясо-пентонным агаром, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей воды, при этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.
Третий день. Выросшие на чашках или в глубине агара в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной для выделения чистой культуры колонии делают распил пробирки, колонию отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат.
Фильтры Зейтца.
- Состоят из 2-ух частей- металлического полого цилиндра и нижней опорной части, завинчивающейся трубкой.
- На опорную сетку кладут асбестовую пластинку.Обе части соединяют винтами и смонтированный фильтр вставляют в резиновую пробку колбы с боковым отростком.
- Подготовленный фильтр обертывают в бумагу и автоклавируют. Фильтрование жидкостей проводят под вакуумным насосом.
Фильтры Шанберлана
- Представляет собой полые цилиндры, напоминыющие свечи.
- Изготовлен из каолина с примесью песка кварца.Стандартизируются по размерам пор и нумеруются.L1-L13. Фильтры L5-L13 бактерий не пропускают.
Фильтры Бенкефельда.
- Имеют вид свечей и изготовлены из инфузорной земли.По величине пор обозначают V, W, N
Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря пористой структуре матрикса, но для пропускания раствора через фильтр требуется вакуум или давление, поскольку сила поверхностного натяжения при таком малом размере пор не дает жидкостям фильтроваться. Существуют 2 основных типа фильтров - глубинные и фильтрующие.
Глубинные фильтры состоят из волокнистых или гранулированных материалов (асбест, фарфор, глина), которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов, поэтому четкие параметры размера пор отсутствуют.
Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в матриксе фильтра, что обеспечивает достаточно большую емкость фильтров, но может приводить к задержке части раствора.
Фильтрующие фильтры готовят из нитроклетчатки, имеют непрерывную структуру, и эффективность захвата ими частиц определяется в основном соответствию их размеру пор фильтра. В зависимости от размеров пор фильтры имеют номера 1-5. Мембранные фильтры имеют низкую емкость, но эффективность не зависит от скорости протока и перепада давлений, а фильтрат почти или совсем не задерживается. Перед использованием фильтры стерилизуют кипячением в дист.воде в теч.20 мин.
Мембранная фильтрация в настоящее время широко применяется для стерилизации масел, мазей и растворов, неустойчивых к нагреванию - раствор для внутривенных инъекций, диагностические препараты, растворы витаминов и антибиотиков, сред для культур тканей и т. д. и т. п.
Контроль стерилизации
1)персонал должен строго соблюдать и документировать установленный режим стерилизации.
2)О поддержании определенной температуры можно судить по изменению окраски химических индикаторов(бензойной кислоты, мочевины), которые помещают на поверх-ти и в глубине стерилизуемого объекта.
3) должен регулярно проводиться технический контроль, помещая внутрь стерилизуемых материалов биотесты., приготовленные из термоустойчивых бацилл.
4)Для микробиол.контроля проводят посев кусочков материала, смывов с предметов после стерилизации на среды, позволяющие обнаружить анаэробные бактерии, грибы.Отсутствие роста через 14 дней инкубации свидет-ет о стерильности материала.
Контроль дезинфекции
Осуществляется путем бактериологического контроля смывов из лечебных и др.учреждений , взятых стерильными ватными тампонами и высеянных на пит.среды. Рост УПМ–неэффективная дезинфекция.
Контроль качества стерилизации и дезинфекции
Контроль режима паровой и суховоздушной стерилизации
Для контроля режимов стерилизации используют три вида контроля:
- химический (каждый цикл стерилизации);
- термический (1 раз в 2 недели);
- биологический (2 раза в год).
Химический и термический контроль режима стерилизации должен проводить оператор парового стерилизатора.
Биологический контроль проводит бактериолог или сотрудник дезинфекционных станций по заказу бактериологической лаборатории. При отрицательном результате контроля использование всей партии материала запрещается, и он повторно обрабатывается.
Химический контроль
Контроль паровой стерилизации
Этот вид контроля проводят при каждом рабочем цикле с помощью бумажных индикаторов стерилизации (НСТО «Винар») или химических веществ — тестеров.
При проведении исследования в контрольных точках рабочей камеры устанавливают герметично запаянные ампулы с химическим тестовым веществом или к стерилизационным коробкам прикрепляют индикаторные полоски.
Число контрольных точек зависит от емкости стерилизационной камеры:
- до 100,0 л - 5 контрольных точек в камере;
- 100,0 л - 750,0 л - 11 контрольных точек в камере;
- свыше 570,0 л - 13 контрольных точек в камере.
1-ая точка находится у загрузочной двери, вторая - у противоположной стенки (в вертикальном автоклаве - в верхней и нижней части камеры). В 1-ой и 2-ой точках тесты располагаются вне стерилизуемых изделий, а в остальных точках тесты располагают в центре стерилизационных коробок.
Контроль суховоздушной стерилизации
Число контрольных точек зависит от емкости стерилизационной камеры:
- до 80,0 л - 5 контрольных точек в камере;
- свыше 80,0 л (однокамерный) - 15 контрольных точек;
- свыше 80,0 л (двухкамерные) - 30 контрольных точек.
В контрольных точках рабочей камеры используют герметично запаянные ампулы с химическим тестовым веществом или индикаторную полоску, которые прикрепляют к упаковкам или стерилизуемым изделиям.
При контроле в 5 точках 1 точка располагается в центре камеры, а точки 2, 3, 4, 5 расположены в нижней части камеры по углам, причем 2 и5 точки находятся перед загрузочной дверью справа и слева, а 3 и 4 точки - глубине камеры.
В случае 15 точек - точки 1, 2, 3 располагаются в центре камеры на трех уровнях сверху вниз; а точки 4-15 - по углам, но также на трех уровнях (точки 4-7 - низ; точки 8-11 - середина; точки 12-15 - верх). Угловые точки нумеруются против часовой стрелки, начиная с правого нижнего угла.
Если контрольных точек - 30, то для каждой камеры их расположение повторяется также как для 15 точек. При этом каждая контрольная точка должка быть расположена на расстоянии не ближе 5,0 см от стенок камеры.
После окончания цикла стерилизации индикаторные системы (ампулы с химическим тестовым веществом) извлекают из контрольных точек сравнивают с эталоном.
Термический контроль
Этот вид контроля проводят 2 раза в месяц, используя поверенный максимальный термометр, цена деления которого не более 1 оС, а диапазон измерений превышает контролируемую температуру. При этом термометр размещают в середине стерилизационной камеры. После окончания цикла стерилизации и остывания термометра до комнатной температуры, снимают показания и заносят в журнал.
Биологический контроль
Этот вид контроля проводят 2 раза в год. Для этого используют биотесты, предназначенные для конкретного вида паровой или суховоздушной стерилизации.
Пронумерованные пакеты с биотестами размещают в контрольных точках стерилизатора. После проведенной стерилизации в пробирки с биотестами вносят 0,5 мл цветной питательной среды, начиная со стерильной пробирки для контроля питательной среды и заканчивая контрольным тестом, не подвергавшимся стерилизации (контроль культур).
Далее пробирки инкубируют. После чего проводят учет изменения цвета питательной среды. В контроле (стерильная проба) цвет среды не изменяется. В пробирке с контролем культуры цвет среды должен измениться на цвет, указанный в паспорте, что свидетельствует о наличии жизнеспособных спор.
Работа считается удовлетворительной, если цвет питательной среды во всех биотестах не изменился. Результаты заносят в журнал и регистрируют.
При необходимости контроля за стерильностью медицинских изделий, подвергнутых стерилизации, лаборант бактериологической лаборатории или операционная сестра под руководством сотрудников баклабораторий осуществляют забор проб на стерильность.
Исследование проводят согласно «Методическим рекомендациям по контролю стерильности изделий медицинского назначения». Пробы засевают на питательные среды с соблюдением правил асептики в боксах бактериологической лаборатории. В случаях, когда контролю подвергаются изделия большого размера, пробы забирают путем смыва с них с помощью стерильной салфетки. При отсутствии роста микроорганизмов во всех посевах из проб изделий одной загрузки в стерилизатор они считаются стерильными. При наличии роста хотя бы на одной питательной среде производят повторный контроль удвоенного количества образцов из данной загрузки.
Метод окраски по Бурри-Гинсу: назначение, техника, результат.
Исп. для окраски капс. бактерий; Основан на том, что капсула не восприн. красители и ее выявл. негатив.контрастир. фона по Бурри.
Техника:
1.На серед. предмет.стекла наносят каплю черной туши и смеш. с каплей культуры капс. бакт. с помощью петли.
2.Краем др. предмет.стекла делаю мазок по типу кровяного=>сушат на возд. и фиксир. в пламени горелки.
3.Окраш. в теч. 5 мин р-ром карболового фуксина,развед. водой 1:3.
4.Промываю водой,высуш.,микроскопир. с иммерсией.
Рез-т: тело бактерии окраш. в красный цвет,неокраш. капсулы контраст. выдел. на темном фоне препарата.