Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать по форме:

Темп. выращивания

Характер роста

Количество колоний

Морф. клеток

Окраска по Граму

Морфология колоний

Диаметр, мм

Форма

Оптические свойства

Цвет

Поверхность

Профиль

Край колонии

Консистенция

27°С

7°С

7°С

3. Изложить выводы по работе.

ТЕМА 2

ОБЩИЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ

Цель занятия:

· Учет микроорганизмов методами:

1) прямого микроскопирования;

2) посева на твердые питательные среды.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. экофизиология микроорганизмов

2. факторы окружающей среды, влияющие на рост и развитие микробов в окружающей среде

3. температура

4. кислотность среды

5. активность воды и соленость

6. редокс-потенциал и кислород

7. свет

8. концентрация питательных веществ

9. местоположение в биосфере

10. дифференциация и переживание неблагоприятных условий

11. экологические ниши микроорганизмов

12. микробное сообщество как целостность

13. синморфология сообществ

14. кооперативные взаимоотношения

15. первичная продукция

16. межвидовой перенос водорода и синтрофия

Оборудование и материалы:

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Чашки Петри с плотной питательной средой.

5. Микробиологические петли.

6. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями, карболовый эритрозин).

Общие сведения

Почвенный покров бесспорно является основным депо раз­нообразных бактерий на Земле. Некоторые бактерии являются типичными обитателями почвы и обычно не обнаруживаются в водной среде или в составе микрофлоры макроорганизмов. Это, например, многие представители порядков Actinomycetales и Myxobacteriales. С другой стороны, для микрофлоры почвы не­характерны спирохеты, виды бактерий, снабженных газовыми вакуолями, метанобразующие бактерии и многие другие ана­эробы. Своеобразием микрофлоры почвы является то, что здесь всегда присутствуют клетки, для которых почва вообще не яв­ляется местом активного развития, или такие клетки, развитие которых может происходить лишь в редкие и случайные перио­ды обогащения почвы подходящим субстратом. Для микроор­ганизмов целинных почв таким случайным субстратом может быть навоз. Его попадание в почву вообще закономерно, но для данного пространственно ограниченного участка это событие вообще может никогда не произойти.

Почва представляет собой весьма гетерогенную среду. В каждой конкретной почве складываются своеобразные микроб­ные ценозы, однако в соответствии с природой почвы как эле­мента биосферы эти ценозы всегда имеют определенную струк­туру.

На xv Международном конгрессе почвоведов, состоявшемся в Мексике в 1994 г., был проведен специальный симпозиум, посвященный проблеме оценки бактериального разнообразия почв. Среди принимавших участие ученых была высказана надежда, что в ближайшее время будет выработана программа исследований почв как генератора биологического разнообразия Земли.

В настоящее время ряд ученых (Добровольских Г.В., Звягинцев Д.Г.) обращают внимание на недооценку роли почвы как среды обитания и сохранения всего разнообразия жизни на планете и почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования экосистемы Земли и ее биосферы и перечисляют главные вопросы, на которые следует ответить в будущем почвенным микробиологам:

1. Как могут существовать в 1 г почвы так много видов (до 4 тыс.) и популяций микроорганизмов?

2. Как связана структура почвенного бактериального сообщества со структурой микробного сообщества в целом?

Отсутствие ответов на вопросы, которые были поставлены очень давно, связано, прежде всего, с ограничением методов почвенной микробиологии. Учет микроорганизмов может быть произведен методами прямого микроскопического счета, чашечным методом посева почвенной суспензии на питательные среды, методом мультисбстратного тестирования (метаболический потенциал сообщества), анализом профилей метиловых жирных кислот, различными модификациями молекулярно-биологических методов. Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.

Ход работы

1. Подготовка материала для анализа

1.1. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ров­ный, волнистый, склон), степени гетерогенности почвы и ее од­нородности в ботаническом отношении. Рекомендуют с площа­ди 100 м² брать пробу из трех точек; с площади, превышающей 100 м², — из пяти по принципу конверта (четыре в точках по уг­лам и одну — ближе к центру прямоугольника); с 1 га и более — из 15 точек. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний слой толщиной 2 см.

Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Можно ограничиться очи­сткой этих предметов, если затем несколько раз воткнуть их в почву изучаемого горизонта. Укладывают образец в, заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную бан­ку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты или пакеты из плотной бумаги. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, гори­зонта и других сведений.

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их в холодном помеще­нии (в холодильнике) в течение двух дней. Для придания сред­нему образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивают почву, вынимают корни растений, различные включения.

2. Приготовление почвенной суспензии

Образцы почв отбирают с пробной площади по 3-5 образцов (рис. 1) весом по 100-200 г в стерильные пергаментные пакеты. Перед подсчетом необходимо добиться, чтобы клетки в суспензии находились в виде

Рис. I. Схема сбора образцов с опытных участков

одиночных свободноплава­ющих клеток. Для выполнения этого условия необходимо осущест­вить три процесса:

1) диспергирование почвенных агрегатов;

2) десорбцию клеток микроорганизмов с почвенных частиц;

3) разделение микроколоний на отдельные составляющие их клетки.

Эти процессы осуществляются одними и теми же приемами:

1) увлажнение почвы до состояния пасты при растирании ре­зиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке 5 мин.

2) обработка на микроизмельчителе тканей РГ-2 5 мин. при 500 об/мин (10 г почвы +90 мл воды)

3) обработка ультразвуком низкой частоты УЗДН-1 (3 мин. при силе тока 0,40 А, частота 15 кГц) (10 г почвы + 90 мл воды)

Рис. 2. Схема последовательных разведений почвы

Для учета микроорганизмов широкое распространение получили:

1) прямые микроскопические методы учета микроорганизмов;

2) учет численности микроорганизмов методом посева на твердые питате­льные среды.

Недостатком первого метода является невозможность разгра­ничить живые и мертвые клетки микроорганизмов. В силу этого данные, полученные по этому методу, превышает фактическое со­держание микроорганизмов в почве. Вторым методом же, наоборот, удается учесть только незначительную часть (0,1-1%микро - населения почвы из-за отсутствия универсальной среды, пригодной для выявления всех живых микроорганизмов почвы.

1) Прямой микроскопический метод учета микроорганизмов. Метод Виноградского в модификации Шульгиной чаще применяют в лабораторной практике. Сущность его в следую­щем. Из средней почвенной пробы берут 5 г и вно­сят в колбу Эрленмейера на 250 мл, содержащую 50 мл сте­рильной водопроводной воды. Навеску почвы предварительно растирают в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с не­большим количеством стерильной воды. Для черноземных и темно-каштановых почв навеску растирают с 0,1%-ным рас­твором пирофосфата натрия. Затем 5 мин встряхивают и в те­чение 2—5 мин дают осесть грубым частицам.

Из полученной взвеси стерильной градуированной пи­петкой берут 0,01 мл и переносят на хорошо обезжиренное стекло. Предварительно на предметном стекле расчерчивают квадрат площадью 4 см². Нанесенную взвесь равномерно распределяют по поверхности. После того, как мазок высохнет, его заливают раствором 0,1%-ного агара (хорошо отмытый агар готовят на дистиллированной воде) и снова высушивают. Покрытый агаром препарат фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 40 мин до одних суток). При ок­рашивании стекла краситель наносят на препарат предварительно покрытым фильтровальной бумагой. Остаток красителя смывают, опуская стекла в воду тыльной стороной. Затем препарат снова сушат и просматривают под микроско­пом с иммерсионной системой.

Для получения более точных результатов подсчитывают 10 полей зрения и определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зре­ния: р = pr². Диаметр поля зрения измеряют при по­мощи объектного микрометра. Затем находят, сколько полей зрения (К) размещается на площади мазка (Р), равной 400 мм² по формуле:

Пример расчета: Если диаметр поля зрения равен 0,16 мм, а площадь поля зрения соответствует 0,02 мм², то

Среднее число клеток в поле зрения умножают на К и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для оп­ределения количества клеток в 1 мл суспензии полученное число умножают на 100, для подсчета в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Использование метода прямого учета почвенных микро­организмов по Виноградскому в модификации Шульгиной по­казало, что в почве содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов, чем удается учесть методом пита­тельных пластин.

2) Учет численности микроорганизмов методом посева на плотной питате­льной среде.

После предварительной подготовки почвы по схеме, указан­ной выше (рис. 2), производят посев в чашки Петри со специа­льными питательными средами. Посев производят из разведений от 1:2 до 1:10000, в зависимости от групп учитываемых микро­организмов, типа почвы, сезона, влажности и т.п. Наиболее то­чный подсчет получается, если на чашке развивается 50-200 ко­лоний бактерий и актиномицетов и 30-50 колоний грибов.

При первых анализах трудно предвидеть, сколько микроор­ганизмов содержится в почве, поэтому делают посев из двух или даже трех последовательных разведений. Для учета грибов и дрожжей берут разведения на 1-2 порядка меньше, чем для уче­та бактерий и актиномицетов.

Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Бактерий подсчитывают через 3 суток.

В чашках Петри сначала учитывают колонии в 100 полях зрения, затем определяют среднее арифметическое для одного поля зрения. Для определения числа колоний на всей чашке среднее число колоний в одном поле зрения умножают на ко­эффициент (К), который равен площади чашки Петри (Р), де­ленной на площадь поля зрения (р):

Диаметр чашки Петри измеряют линейкой, а диаметр поля зрения — под микроскопом, используя для малых увели­чений миллиметровую бумагу, а для больших (объективы 40 х и 90х) — объективный микрометр.

Подсчитав при поверхностном посеве число колоний на чашке, находят содержание клеток в 1 мл соответствующего разведения, умножая число колоний на 20, так как посеяно было 0,05 мл суспензии. Чтобы определить количество клеток в 1 г сырой почвы, их содержание в 1 мл умножают на степень разведения (10³, 10⁴, 10⁵ и т. д.).

Для учета микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы число клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолют­но сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета. Установлено, что при поверхностном посеве почвенной суспензии из разведения 10^-3 число колоний на чашке равно 52; влажность почвы — 25%; при такой влажности 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы. Число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы (х) определяют следующим образом: