II. Величина микроорганизмов.
Величину измеряют в микрометрах. Размеры микробов могут колебаться в значительных пределах от 150 мкм (гиганты) – кристиспиры (свободно живущие в сточных водах и открытых водоемах), 10-12 мкм - крупные (лептоспиры, клостридии), 2-3 мкм - средние (молочнокислые бактерии) и до 0,5 мкм - мелкие (бруцеллы).
III. Взаимное расположение микроорганизмов в мазке может быть:
а) беспорядочное, “россыпью” - микрококки, сальмонеллы;
б) кучками, скоплениями – микобактерии туберкулеза;
в) в виде частокола ( ///// ) - листерии, возбудитель псевдотуберкулеза;
г) в виде римской цифры V - листерии;
д) в виде “летящей чайки” ~~ кампилобактерии;
е) цепочками, длинными нитями – стрептококки, железобактерии.
ж) нитчатые совбодноживущие бактерии могут быть объединены в трихомы (см.выше).
IV. Особенности внутренней структуры.
У некоторых микробов может отмечаться наличие биполярности, спор, капсул.
V. Подвижность микроорганизмов.
Движение микроорганизмов чаще происходит благодаря наличию жгутиков, которые представляют собой тончайшие извитые нити, отходящие от тела бактерий. Однако существуют и другие механизмы подвижности.
Контрольные вопросы:
1. Красители, применяемые в бактериологической практике.
2. Принцип приготовления спиртовых, спиртово-водных и водных растворов красок.
3. Основные морфологические признаки микроорганизмов.
4. Механизмы движения. Таксис.
Тема № 4
Простые и сложные методы окраски
При простых методах окраски применяют только один краситель, чаще всего фуксин Пфейфера, метиленовый синий. Раствор красителя наносят на препарат и выдерживают 2-3 минуты, затем краску смывают водой, препарат высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают под иммерсионным объективом микроскопа. Простая окраска позволяет обнаружить в материале бактерии, быстро определить их морфологию и иметь представление о разнообразии видов.
Сложные методы окраски основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток, их применяют для дифференциации (отличия) одних бактерий от других. Сущность этих методов заключается в последовательном воздействии на мазок двух красящих растворов, из которых один является основным, другой - контрастным. Кроме красящих растворов, применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты. В результате разные виды микробов или отдельные структуры внутри микробной клетки окрашиваются в контрастные и разные цвета.
Окрашенные препараты имеют следующие преимущества:
а) они не опасны, т.к. все манипуляции проводят с фиксированным (обезвреженным) материалом;
б) в них легко различимы отдельные детали структуры микробной клетки, не выявляющиеся в неокрашенном препарате;
в) могут хорошо храниться длительное время и, следовательно, являются доказательством проведенных исследований, кроме того, их можно использовать для учебных целей;
К недостаткам окрашенных препаратов следует отнести:
а) невозможность изучения физиологии микробов (подвижность, характер деления и т.д.)
б) деформацию микробных клеток после фиксации физическим методом и воздействия красящих растворов.
Окраска мазков по Граму
Из сложных методов наибольшее практическое значение имеет метод окраски по Граму. Этот метод позволяет разделить все микробы на грамположительные (грампозитивные), и грамотрицательные (грамнегативные).
Метод окраски по Граму
1) на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую наносят раствор карболового генцианвиолета на 2 минуты;
2) пинцетом удаляют бумагу, краску сливают и не промывают водой;
3) наносят раствор Люголя на 2 минуты;
4) сливают раствор Люголя;
5) наносят йодированный спирт на 2 мин. (или 96о этиловый спирт 30 сек.);
6) промывают мазок водой;
7) докрашивают фуксином Пфейфера 2 минуты;
8) краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.
Сущность метода окраски по Грамусостоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стенки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствором Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате краситель оказывается как бы «запертым» и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина окрашиваются в фиолетовый цвет.
У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тонкий и не оказывает существенного влияния на проницаемость клеточной стенки; кроме того, они содержат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет.
Модификация метода Грама по Синёву. В настоящее время широкое применение в практике бактериологических исследований нашел видоизмененный способ окраски по Граму, предложенный Синёвым. Раствор основного красителя заменяют фильтровальной бумагой пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллвиолета. На препарат помещают окрашенную бумагу и наносят на нее 2-3 капли воды. Окрашивание идет в течение 2 минут, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым методом.
Фуксин Пфейфера можно заменить аналогично изготовленной красящей фильтровальной бумагой.
Окраска кислото-спирто-щелочеустойчивых микроорганизмов
В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Мyсobacterium. Среди них встречаются непатогенные (обитающая в сене и впервые обнаруженная в трафе-тимофеевке палочка тимофеевой травы, смегмозная палочка и др.), которые обнаруживают в масле, молоке, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных (Myсobacterium tuberculosis), возбудителя паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота (Мyсobacterium paratuberculosis), возбудителя проказы (лепры) у человека (Мyсobacterium leprae).
У рыб болезни, вызываемые микобактериями, называются микобактериозы. Болезнь поражает самых различных рыб. Болезнь чаще протекает хронически, реже в острой форме, когда во внутренних органах обнаруживаются массовые скопления возбудителя. Заражение проходит при заглатывании бактерий с водой, у лососевых при поедании заболевших и погибших рыб. Установлено, что у живородящих тропических рыб наблюдается трансовариальный путь заражения- через зародышей, в которых развивается бактерия. В отношении рыб, мечущих икру, этот путь не доказан.
После обнаружения у рыб микобактерий в литературе высказывались предположения по поводу возможности распространения рыбами туберкулеза человека. Исследования последних лет показали несостоятельность этого предложения, однако было установлено, что при некоторых условиях микобактерии пойкилотермных животных могут сохраняться у теплокровных, и наоборот.возбудителем тубекулеза человека и теплокровных животных являются бактерии, относящиеся к тому же роду Мyсobacterium.
Клинические признаки не очень характерны. Заболевшие рыбы теряют аппетит, теряют в весе, окраска тела становится бледнее, наблюдаются дефекты чешуи и иногда появляютя язвы, разрушение плавников, пучеглазие и выпадание глазного яблока. У лососевых отмечены более яркая окраска тела и недоразвитие вторично-половых признаков.
При вскрытии рыб в печени, реже в почках и селезенке, обнаруживаются так называемые псевдоцисты в виде сероватых узелков, очень напоминающие капсулу гриба Ichthyosporidium. Псевдоцисты содержат скопление лейкоцитов, фагоцитировавших бактерий, а также самих бактерий. При остром течении болезни микобактерии выявляются на нативных и окрашенных мазках крови, взятой из внутренних органов. В некоторых случаях наблюдается скопление экссудата в плавательном пузыре и полости тела.
Диагноз ставится комплексно, учитывая клиничерезультаты ские данные, патологоанатомического вскрытия и подтверждается лабораторными методами. Особенно тщательно микобактериозы должны быть отдифференцированы от ихтиоспоридиоза. Дифференциальный диагноз может быть поставлен по наличию или отсутствию в псевдоцистах микобактерий..
В качестве возбудителей зарегистрированы многочисленные виды рода Мyсobacterium, однако в 9-ом издании Берджи оставлены 2 вида: Мyсobacterium marinum, Мyсobacterium fortuitum. Все остальные рассматриваются как синонимы.
Изучение микобактерий представляет интерес и с эпидемиологической точки зрения, так как доказано, что Мyсobacterium marinum может вызывать инфекцию у теплокровных животных и человека. На коже людей на месте внедрения появляются локальные эритемодермальные папулы. Входными воротами служат различные ссадины,раны. Особую опастность представляет рыбоводам,владельцам декоративных аквариумов и потребителей.
Все они палочковидные бактерии, грамположительные, неподвижные. Характерной особенностью является сильно выраженная кислотоустойчивость.
Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и наличием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие растворы. Поэтому применяют красители с протравителями и нагреванием мазка над пламенем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.