Порядок работы с иммерсионной системой

1. Выбирают объектив с увеличением х90 или х100.

2. Поднимают конденсор и открывают диафрагму.

3. Наводят свет под малым увеличением сухой системы (х8).

4. На препарат наносят небольшую каплю иммерсионного (кедрового) масла и, глядя сбоку, под контролем глаза, иммерсионный объектив осторожно опускают, погружая его в масло.

5. Тубус очень медленно поднимают, вращая сначала макро-, а затем микрометрический винт, при помощи которого настраивается ясное изображение объекта (микровинт поворачивают не более чем 0,5 оборота в ту или другую сторону). Препарат просматривают в нескольких полях зрения.

6. После просмотра препарата масло с иммерсионного объектива удаляют чистой марлевой салфеткой и переводят револьвер на объектив малого увеличения (х8).

Темнопольная микроскопияпозволяет наблюдать живые бактерии.

При микроскопии этим методом лучи освещающие объект, не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся. Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора (параболоид или кардиоид).

Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют как

для светлого поля, и, заменив конденсор на специальный, прибавляют свет до максимума. Препараты для исследования в темном поле готовят на очень чистых предметных и покровных стеклах определенной толщины: предметные – не более 1,2 мм, покровные – 0,17 мм.

Фазово-контрастная микроскопияпозволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счет повышения их контрастности. Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света.

При прохождении света чрез неокрашенные объекты изменяется фаза

световой волны, что и используется в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. Меняется скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью света в окружающей среде. Она будет большой или меньшей в зависимости от того будет ли показатель светопреломления объекта соответственно больше или меньше, чем в окружающей среде. Эти колебания, называемые фазовыми, так как при них меняется только фаза колебания прошедшего света характерны для большинства биологических объектов.

Глаз человека не способен воспринимать фазовые изменения света. По-

этому неконтрастные (фазовые) объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми. Zernike предложил специальное устройство конденсора и объектива, которые регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаз.

Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного био-

логического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим образом. Кондерсор и объектив заменяют фазовыми. Основным условием является оптимальная освещенность, которая достигается установкой света по Келлеру. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светлопольному конденсору. Только после этого устаналивают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу. Используют объективы апохроматы. Окуляр обычного светового микроскопа заменяется на вспомогательный, который настраивают на изображение двух колец (кольцевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. Центрировочным устройством конденсора добиваются совмешения колец. Заменив вспомогательный окуляр на обычный можно производить исследование препарата.

Поляризационная микроскопия позволяет получить изображение неокрашенных анизотропных структур; интерференционная микроскопия, объединяющая принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии применяется для получения контрастного трехмерного изображения неорашенных обектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номаркского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом.

Контрольные вопросы:

1. Назначение и принцип устройства бактериологической лаборатории.

2. Правила поведения и работы в лаборатории.

3. Правила взятия и пересылки патологического материала.

4. Методы микробиологического исследования.

5. Принцип работы с иммерсионной системой микроскопа.

Тема № 2

Приготовление прижизненных
препаратов

Основное требование при работе с микроорганизмами – соблюдение асептики, т.е. таких условий, при которых в пробирку с изучаемой культурой не могли бы попасть другие микроорганизмы (например, из воздуха, с предметов, используемых в процессе выполнения работы). Кроме того, нужно иметь в виду, что среди микроорганизмов многие условно патогенны, что требует повышенного внимания и аккуратности в работе.

Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели. Бактериологические петли изготовляют из проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм (рис. 10).

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Пробирки со средами и культурами при работе следует устанавливать на штативах.

Бактериологическая петля прокаливается, пробки и край пробирки фламбируются. Если в работе используют суспензии микроорганизмов или культуры, выращенные на жидких средах, их берут предварительно простерилизованной пипеткой, у которой широкий конец закрыт ватой. Такие пипетки стерилизуют и хранят завернутыми в бумагу (каждая отдельно).

Изучают микроорганизмы, изготавливая препараты из них. Для этого применяют чистые, хорошо обезжиренные стекла, на поверхности которых капля воды свободно растекается.

При микроскопировании можно использовать препараты из культур, выращенных в жидких средах. Небольшое количество бактериальной массы из культуры, выращенной на плотных средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной бактериологической петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или физиологического раствора. В зависимости от цели исследования готовят прижизненные или фиксированные препараты.

Определение подвижности у микробов

В практике бактериологических лабораторий часто исследуют живых бактерий с целью определения подвижности, т.к. это важный видовой признак, имеющий диагностическое значение. Поэтому все микробы делят на две группы: подвижные и неподвижные.

Например, возбудитель сибирской язвы и антракоиды (сибиреязвенно-подобные бациллы) сходны по ряду морфологических и культуральных признаков, однако сибиреязвенная бацилла неподвижна, а антракоиды – активно подвижны.

Движение микробов происходит при помощи: а) жгутиков, которые представляют собой тончайшие извитые нити, отходящие от тела бактерий; б) змеевидных движений тела; в) реактивного движения по поверхносям при одновременном резком выделении слизи; г)аэросом – специальных органоидов, заполненных газом, из глубины водоёма к поверхности.

Для прижизненных наблюдений наиболее часто готовят препараты

«раздавленная капля» или «висячая капля».

Метод «раздавленной капли»:

1. На предметное стекло носят каплю физиологического раствора.

2. Бактериологической петлей вносят культуру микроорганизма с плотной питательной среды (при исследовании микробной культуры, полученной с жидкой питательной среды, физиологический раствор наносить не надо).

3. Каплю накрывают покровным стеклом.

Метод «висячей капли»:

1. На края предметного стекла с лункой наносят тонкий слой вазелина.

2. В центр покровного стекла помещают каплю микробной культуры. Капля должна быть круглая, выпуклая, с ровными краями.

3. Переворачивают предметное стекло и накрывают им каплю на покровном стекле так, чтобы она оказалась напротив центра лунки (Рис.3).

В таких условиях капля дольше не высыхает и легче соблюдать технику безопасности.

В обоих случаях микроскопию проводят в затемненном поле: конденсор опускают, диафрагму суживают. Объектив х40 или х90 (под иммерсией).

На светло-сером фоне микробы темно-серые.

Рис. 3. Метод «висячей капли».

Прижизненная окраска микробов

Для изучения морфологических особенностей микробов проводят их прижизненную окраску, с целью определения подвижности, характера деления, реакции на химические вещества и т.п.

Живые микробы мало восприимчивы к красителям, окрашиваются только погибшие клетки.

При микроскопических исследованиях для прижизненной окраски микробов используют:

Метод Фиккерта:

На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры, в которую вносят каплю нейтральрота перемешивают и накрывают покровным стеклом так, чтобы жидкость доходила до края покровного стекла.

Микроскопируют немедленно под увеличением объектива х40. Кроме выявления формы микроба определяют его подвижность.

Метод Наканиши:

1. На предметное стекло наносят каплю горячего 0,001% раствора метиленового синего и высушивают в термостате.

2. Салфеткой тщательно растирают каплю по поверхности стекла до бледно-голубого цвета.

3. На окрашенном стекле готовят препарат «раздавленная капля»
(см. определение подвижности у микробов).

4. Краска растворяется, и микробы окрашиваются сначала в голубой, а потом в синий цвет.

Для более детального изучения морфологии микроорганизмов, их тинкториальных свойств готовят фиксированные, окрашенные преараты на предметных стёклах.