Окрашивание клеточной стенки таннином

1. Приготовить фиксированный препарат

2. Окрасить препарат 20% водным раствором таннина в течение 20-30 минут.

Микроскопическая картина: клеточная стенка окрашивается в жёлто-коричневый цвет.

Окрашивание ядер флуорохромом

1. Приготовить прижизненный препарат.

2. Добавить водный раствор акридинового оранжевого (1:5000) и выдержать в течение 10 минут.

3. Рассмотреть препарат в люминесцентном микроскопе.

Микроскопическая картина: цитоплазма – тёмно-зелёная, ядра – светло-зелёные, метахроматин – ярко-красный, вакуоли – розовые.

Окрашивание ядер нейтральным красным

1. Приготовить фиксированный препарат.

2. Окрасить препарат нейтральным красным в течение 5 минут.

3. Слить краситель и промыть препарат водой.

4. Рассмотреть препарат в люминесцентном микроскопе.

Микроскопическая картина: цитоплазма – зелёно-жёлтая, ядра – красные.

Выявление запасных полисахаридов

Гранулы полисахаридов выявляют при обработке клеток насыщенным раствором Люголя.

1. Внести культуру гриба в каплю раствора Люголя на предметном стекле.

2. Добавить каплю 1% НСl.

3. Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Гранулы гликогеноподобных полисахаридов окрашиваются в красно-коричневый цвет. Полисахарид может быть распределён в цитоплазме или вакуолях не в виде гранул, а диффузно – в виде коричневатой области.

Выявление запасных липидов

Окраска запасных липидов в клетках грибов проводится также, как и окраска липидоподобного вещества прокариот - поли-β-оксимасляной кислоты.

3.6.1 Способ 1

1. Приготовить в воде прижизненный препарат на предметном стекле.

2. Добавить каплю раствора судана III.

3. Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Капли липидов окрашиваются в красно-бурый цвет, цитоплазма остается бесцветной.

Способ 2

1. Приготовить прижизненный препарат в воде на предметном стекле.

2. Добавить каплю 40% формалина и выдержать 5 минут.

4. Добавить каплю метиленового синего, выдержать 10 минут.

5. Добавить каплю судана III.

6. Выдержать 5 минут, накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Капли липидов окрашиваются в розовый или оранжевый цвет, цитоплазма - в синий.

Выявление липидов без окрашивания

1. Приготовить препарат грибов в воде или в красителе метиленовом синем.

2. Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Липиды видны в цитоплазме как сильно преломляющие свет (как бы светящиеся) капли.

Выявление полифосфатов

Полифосфаты (волютин, метахроматин) как резерв фосфорной кислоты образуются в клетках как прокариот, так и эукариот, и выявляются одинаковыми методами.

Окраска полифосфатов по методу Лёффлера

Метод основан на свойстве метахромазии – способности полифосфатов изменять цвет красителя (метиленового синего) - с синего на красный.

Фиксированный препарат окрасить в течение 5 минут метиленовым синим по Лёффлеру.

1. Краситель слить, препарат промыть водой, высушить и микроскопировать.

Микроскопическая картина: гранулы полифосфатов окрашены в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма - в голубой.

Окраска полифосфатов по методу Омелянского

Метод основан на плохой растворимости полифосфатов в кислоте.

1. Приготовить тонкий фиксированный препарат культуры.

2. Окрасить препарат фуксином Циля в течение 30 секунд.

3. Краску слить, препарат промыть водой.

4. Залить препарат на 20-30 секунд 1% раствором серной кислоты и немедленно промыть водой. Серная кислотаобесцвечиваетцитоплазму, а гранулы полифосфатов остаются окрашенными.

5. Препарат окрасить метиленовым синим (1:40) 20-30 секунд.

6. Промыть препарат водой, высушить.

Микроскопическая картина: гранулы полифосфатов окрашены в красный, цитоплазма клетки - в голубой цвет.

Выявление полифосфатов в вакуолях

Гранулы полифосфатов у эукариот образуются не только в цитоплазме, но и в вакуолях, где они часто движутся за счёт броуновского движения и поэтому их называют «пляшущими тельцами».

1. Приготовить препарат грибов в воде или в красителе метиленовом синем.

2. Накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Полифосфаты видны в вакуолях как дрожащие и переворачивающиеся гранулы.

Оформление результатов работы

1. Приготовить препараты и провести дифференциальную окраску:

1.1 Клеточной стенки таннином.

1.2 Запасных питательных веществ (гликогеноподобных полисахаридов, липидов, полифосфатов).

1.3 Ядра с помощью флуорохромов.

2. Приготовить прижизненные препараты из центра и края грибной колонии. Рассмотреть цитоплазму и зарисовать, обозначая вакуоли и гранулы.

5 Контрольные вопросы

1. Каков химический состав клеточной стенки грибов разных классов?

2. Назовите мембранные системы клетки грибов и их функции.