Работа № 4. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах

ЗАНЯТИЕ № 1.1.4

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБОВ

Цель занятия:

изучить культуральные и биохимические свойства бактерий; основные биологические свойства аэробов, методы выявления чистых культур аэробов с целью их идентификации.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

Метаболизм бактерий.
Питание бактерий.
Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.
Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
Основные принципы культивирования.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

· описать культуральные и биохимические свойства бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению возбудителей.

Работа № 1. Методы выделения и идентификации аэробных бактерий

Цель: изучить основные методы выделения и идентификации аэробов (см. теоретическую справку).

III

А)

Работа № 4. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах - student2.ru

Ж)

Б)

)

Е)

В)

Д)

Реакция агглютинации

Г)

I. Сбор исследуемого материала

II. Посев исследуемых микроорганизмов на простые, ДДС и элективные питательные

среды с целью получения изолированных колоний

III. Накопление чистой культуры на скошенной питательной среде

IV. Идентификация выделенной чистой культуры

А) изучение морфологических и тинкториальных свойств

Б) изучение культуральных свойств

В) изучение антигенной структуры возбудителя с помощью постановки реакции агглютинации на стекле с поливалентными и монорецепторными сыворотками

Г) изучение биохимических свойств возбудителя по результатам посева на среды Гисса

Д) определение чувствительности микробов к антибиотикам, с помощью метода бумажных дисков

Е) проба с бактериофагами (реакция фаголизабельности)

Ж) биопроба на лабораторных животных – изучают клинику и патогенез заболевания

* проведение внутривидовой идентификации для выявления источников инфекции (фаготипирование)

Работа № 2. Питательные среды

Цель: ознакомиться с питательными средами, используемыми для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях.

Самостоятельная работа: классифицировать предложенные питательные среды; результаты оформить в виде таблицы (см. теоретическую справку).

среда	происхождение	консистенция	назначение
	естест-венное	искусст-венное	жидкая	полу- жидкая	плотная	общего	ДДС	электив- ные
Мясо- пептонный агар (МПА)
Мясо- пептонный бульон (МПБ)
Среда Эндо
Кровяной агар
Тиогликолевая среда
Среды Гисса
Среда Сабуро
Свернутая сыворотка
Желточно- солевой агар (ЖСА)

Вывод:

Работа № 3. Характер роста бактерий на плотных питательных средах

(культуральные свойства)

Цель: изучить культуральные свойства микроорганизмов на плотных питательных средах.

Самостоятельная работа: по предложенным критериям описать колонии микроорганизмов, выросших на МПА (посев воздуха); результаты внести в таблицу; сделать вывод.

Критерии	Описание	Колонии
1) Форма	Округлая, овальная
2) Размер	Мелкий – 1-2 мм; средний – 3-4 мм; крупный 5 мм и более
3) Характер края	Ровный (S-форма); неровный (R-форма): зубчатый, звездчатый, фестончатый, волнообразный и др.
4) Пигмент (цвет)	Пигментированные колонии – цвет колоний отличается от цвета питательной среды (пигмент м.б. малиновый, белый, желтый, зеленый, золотистый и др.). Непигментированные – колонии под цвет питательной среды
5) Поверхность	Плоская, выпуклая, куполообразная, с выпуклым центром, с вогнутым центром, шероховатая, бугристая и т.д.
6) Прозрачность	Непрозрачные, полупрозрачные, прозрачные
7) Структура	Гомогенная, негомогенная
8) Консистенция (вязкость)	Сухая, вязкая, слизистая, маслообразная, сметанообразная и т.д.

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 4. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах

Цель:изучить особенности роста микроорганизмов на жидких питательных средах.

Самостоятельная работа: описать культуральные свойства бактерий на МПБ и 1% ПВ, зарисовать, сделать вывод.

Опыт № 1 Опыт № 2 Опыт № 3

МПБ МПБ 1% пептонная вода

(кишечная палочка) (возбудитель газовой гангрены) (возбудитель холеры)

1 2 3 4

______________________________________________________________________________

Подпись преподавателя______________________________________________________________

Теоретическая справка

к работе № 1

Основные принципы выделения и идентификации чистых культур бактерий

Бактериологический метод является основным при диагностике инфекционных заболеваний. Его сущность заключается в определении вида возбудителя инфекции, следовательно, можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основной недостаток метода – длительность исследования – от 3-х до 5-ти суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдать ряд правил:

1. Забор исследуемого материала следует провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды, необходимо соблюдать строжайшую антисептику. Для этого используют стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятия материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.

2. Транспортировку полученного материала следует проводить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

- фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

- предполагаемый диагноз заболевания;

- предшествующая антимикробная терапия;

- характер материала;

- дата и время взятия материала;

- цель исследования;

- название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

- подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа:

1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток).

2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на плотную или жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств (характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах; они устанавливаются по характеру роста на питательной среде), отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучение патогенности и персистентных свойств.

К работе № 2

Микроорганизмам, как всему живому, присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение.

Питание необходимо для синтеза в клетке всех органических структур, оно осуществляется с поглощением энергии. Основным источником энергии являются окислительно-восстановительные процессы (дыхание). Для питания нужны органогены: О, С, Н, N, F, K, Mg, Ca; микроэлементы: Na, Zn, Cu, Cl, Mn, Mo, Co, Ni, W; факторы роста: витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, липиды. Кислород и водород микробы берут из воздуха и воды.

По типу питания микробы делятся на аутотрофов и гетеротрофов. Аутотрофы усваивают азот и углерод из неорганических веществ (углекислый газ и др.), а гетеротрофы - из сложных органических соединений (аминокислоты, моносахара и др.), синтезированных ранее другими живыми организмами. Гетеротрофы в свою очередь делятся на сапрофитов и паразитов. Сапрофиты нуждаются в органических соединениях мертвого субстрата, а паразиты получают питательные вещества в организме-хозяине. Паразиты могут быть облигатными (внутриклеточными) и факультативными. Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии) лишены способности жить и размножаться вне клеток хозяина, т.к. зависят от их метаболизма. Факультативные паразиты (гонококки, стафилококки и др.) могут питаться как в организме, так и вне его, поскольку обеспечены автономными ферментными системами при образовании веществ и энергии.

Требования к питательным средам:

- питательность

- изотоничность

- оптимальная реакция среды (рН 7.2 – 7.4)

- влажность

- стерильность

- буферность

- унифицированность

Питательные среды (состав некоторых питательных сред)

Кровяной агар. Используют для выявления экзотоксина – гемолизина у бактерий. К расплавленному и охлажденному до 45°С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.

Пептонная вода. Используют для культивирования холерных вибрионов. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8-8,9, стерилизуют.

Свернутая сыворотка. Применяют для культивирования прихотливых бактерий (например, дифтерийной палочки). Для приготовления свернутой сыворотки используют нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота. Можно пользоваться человеческой сывороткой (отходами производства гамма-глобулина). Для свертывания сыворотку стерильно разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки укладывают в ряд (скос должен начинаться от дна пробирки) в аппарате для свертывания, подогретом до 50⁰C. Температуру доводят постепенно до 80⁰C и держат в нем пробирки 1 ч. Затем пробирки со свернутой сывороткой вынимают (так как дальнейшее нахождение их в свертывателе ведет к высыханию сыворотки) и охлаждают при комнатной температуре. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду.

Среды Гисса с углеводами. Дифференциально-диагностическая среда, на которой выявляют разложение углеводов микроорганизмами. Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде - 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

Мясопептонный агар (МПА). Применяют для выращивания большинства сапрофитных бактерий. К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С.

Среда 199. Используют для выращивания культур клеток. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Для выращивания клеток (как ростовую) среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.

Среда Эндо. Дифференциально-диагностическая среда для культивирования бактерий кишечной группы. Готовят непосредственно перед применением. К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

Среда Левенштейна-Йенсена. Используют для культивирования микобактерий туберкулеза. Для приготовления этой среды в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют: аспарагина 3,6 г, фосфата калия однозамещенного 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют 15 мин при 120 °С. Готовят 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45-60°С, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и оставляют для свертывания в наклонном положении при 85°С 45 мин.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов. Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые препятствуют размножению других микробов, что обеспечивает элективность среды. Готовят среду из питательного солевого агара. В расплавленный и остуженный до 45 ⁰С агар добавляется куриный желток.

Среда Сабуро. Предназначена для выращивания дрожжевых и плесневых грибов. Содержит пептон -10,0 г/л; глюкозу - 40,0 г/л; агар-агар — 15,0 г/л. Благодаря содержанию 4% глюкозы наблюдается оптимальный рост грибов, а рН 5,6 подавляет рост бактерий.

Тиогликолевая среда. Используют для культивирования и выделения облигатных и факультативных анаэробов и микроаэрофильных бактерий и теста на стерильность различных биоматериалов. Казеиновый пептон 15,0; дрожжевой экстракт 5,0; глюкоза 5,5; L-цистин 0,5; хлористый натрий 2,5; тиогликолят натрия 0,5; резазурин натрия 0,001; агар-агар 0,75. Редуцирующие вещества, такие как тиогликолят и цистин - обеспечивают анаэробные условия, достаточные даже для строгих анаэробов. Более высокая вязкость жидкой тиогликолевой среды защищает растущую культуру от быстрого проникновения кислорода. Любое увеличение содержания кислорода регистрируется окислительно-восстановительным индикатором резазурином натрия, который при этом краснеет. Инокулируют питательную среду исследуемым материалом, следя за тем, чтобы он попал на дно пробирки. Для создания анаэробных условий, на поверхность питательной среды можно наслоить стерильное парафиновое масло или агар-агар высотой 1 см. Инкубировать в течение нескольких дней при оптимальной температуре 37^оС. Анаэробы растут в нижней части пробирки.

К работе № 3, 4

Метод Дригальского

Берут 3 чашки Петри с МПА, стерильной пипеткой материал помещают на поверхность МПА в чашку № 1

посев шпателем (газоном) посев петлей (штрихом)

Стерильным шпателем материал Чашку Петри с МПА делят на

тщательно распределяют по 4 сектора. Исследуемый мате-

поверхности агара. Затем, не беря риал стерильной петлей вносят

нового материала и, не обжигая в 1 сектор и делают штрихи,

шпателя, делают посев на 2 и 3 затем такие же линии проводят

чашку МПА. и на других секторах.

На последних секторах вырастают

отдельные колонии.

Работа № 4. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах - student2.ru 1 2 3 1 2

изолированные колонии 4 3

4 сектор - изолированные колонии

Снижение концентрации микробов

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Метод седиментации по Коху -основан на свободном оседании микроорганизмов на питательную среду в чашку Петри из воздуха. Применяется для определения загрязненности воздуха микроорганизмами.

Метод укола -применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, т.к. рост по ходу укола типичен для ряда бактерий. Также применяется для длительного хранения культур.

Посев на скошенный агар – применяется для накопления биомассы, получения чистой культуры и их хранения.

Метод фильтрации основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине.

Этот метод применяется для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

Метод Шукевича

Техника посева. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды дают «ползущий» рост по скошенному агару. Для получения чистой культуры ее отсевают с верхнего края посева.

Метод прогревания

Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. Вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

Бактериостатический метод (метод ингибирования)

Основан на избирательном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Например, антибиотики позволяют очистить исследуемый вируссодержащий материал от сопутствующей бактериальной флоры. Серная кислота (5% р-р) быстро убивает большинство бактерий, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.

Метод заражения лабораторных животных или растений

Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений.

После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.

Посев на жидкие питательные среды

Применяют для изучения типа дыхания микробов. Посев проводится петлей или пипеткой. Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион) – рост на поверхности питательной среды; факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка) – диффузный рост в толще питательной среды; анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены) – придонный рост.

к работе № 5