Иммунодиагностические реакции
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ И МИКРОБИОЛОГИИ
Е.Г. Доркина
ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Методические указания для самостоятельной внеаудиторной работы студентов 1-ого курса (очная форма обучения)
по дисциплине С2.Б.12 - микробиология
Пятигорск 2012
УДК 576. 8. 097 (076.5)
ББК 52.6 я 73
Д 68
Рецензент: зав. кафедрой биологии и физиологии, к.б.н. Л.Е. Назарова
Е.Г. Доркина
Д 68 Иммунодиагностические реакции: методические указания для самостоятельной внеаудиторной работы студентов 1-ого курса (очная форма обучения) по дисциплине С2.Б.12 – микробиология/ Е.Г. Доркина. – Пятигорск: Пятигорская ГФА. 2012. –30 с.
Методические указания составлены в соответствии с Примерной программой по микробиологии, утвержденной в соответствии с ФГОС ВПО-3 для студентов 1 курса очной формы обучения. Материал указаний содержит описание механизмов, особенностей и методов постановки основных иммунодиагностических реакций. Доступная форма изложения материала в сочетании с рисунками и таблицами поможет студентам в усвоении материала при подготовке к занятиям, подготовке домашних заданий и проведении самостоятельной работы на занятиях.
УДК 576. 8. 097 (076.5)
ББК 52.6 я 73
Допущено к внутривузовскому изданию
Председатель ЭМС
проф. _____________________ В.В. Гацан
Протокол № от « » 2012 г.
Ó Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2012
ВВЕДЕНИЕ
Для изучения данного раздела курса микробиологии программой предусмотрены 2 часа лекций и 4 часа лабораторных занятий.
Цель раздела.
Изучить механизмы, особенности и методы постановки различных иммунодиагностических реакций. Научить студентов использовать эти знания для идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.
Учебно-целевые вопросы.
Сущность реакций иммунитета. Получение диагностических сывороток. Реакция агглютинации и её разновидности; реакция преципитации и её разновидности (реакция кольцепреципитации, реакции преципитаций в геле, иммуноэлектрофорез); реакции лизиса (реакция гемолиза и бактериолиза); реакция связывания комплемента. Реакции иммунитета с меченными компонентами: РИФ, ИФА, РИА, иммуноблотинг. Реакция нейтрализации токсина антитоксином и реакция нейтрализации вирусов.
Занятие № 13
Тема: Реакции иммунитета: механизм, ингредиенты, способы постановки, учет результатов, практическое применение реакций агглютинации, преципитации и РСК (ПК-1, ПК-49).
Задачи для самоподготовки с алгоритмами решений.
Задача № 2. Охарактеризовать получение диагностических сывороток.
Для этого надо знать:
В реакциях иммунитета используют диагностические сыворотки. К диагностическим сывороткам относятся:
1. Агглютинирующие, выявляющие корпускулярные антигены (целые бактериальные клетки).
2. Преципитирующие, выявляющие некорпускулярные (молекулярные) антигены.
3. Гемолитическая, используемая в реакции связывания комплемента.
4. Антитоксические и антивирусные, используемые для типирования токсинов и вирусов в реакциях нейтрализации.
Иммунные диагностические сыворотки получают путём многократного введения животным в нарастающих дозах определённых антигенов: убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, токсинов и анатоксинов. Этот процесс называется гипериммунизацией. Для активации антителообразования применяют адъюванты (полный адъювант Фрейнда, гидроокись алюминия).
После определённого цикла иммунизации у животных берут кровь и определяют титр антител. Если в сыворотке содержится достаточное количество антител, делают массивное кровопускание. Из собранной крови отделяют сыворотку, добавляют консервант (мертиолат, хинозол), проверяют на стерильность и разливают в ампулы.
Выпускаются также люминесцирующие сыворотки, иммуноглобулины которых метят флюорохромами (микроорганизмы, обработанные такими сыворотками, светятся в ультрафиолетовых лучах люминесцентного микроскопа). Эти сыворотки применяются для ускоренной диагностики инфекционных заболеваний.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
Под непрямой, или пассивной агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействует с антигенами, адсорбированными на эритроцитах или частицах, которые при этом склеиваются. В качестве адсорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, то есть адсорбируют на эритроцитах не антигены, а антитела.
РНГА нашла широкое применение в серодиагностике различных инфекций, а также для идентификации различных микроорганизмов и для определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам благодаря очень высокой чувствительности и специфичности.
Занятие № 14
Постановка реакции.
1. Исследуемый материал наносят на предметное стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне, 10 мин, при комн. t0), высушивают 20 мин, 370С.
2. На фиксированный мазок наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические антитела, меченные изотиоцианатом, 30 мин, 250С (во влажной камере).
3. Промывка буферным раствором, 10 мин, 250С.
4. Люминесцентная микроскопия: сначала при 40х, а затем – 90х (обращают внимание не только на наличие свечения, но и его интенсивность, характер распределения).
Учет реакции. «+» реакция –клеткисветятся (видимый эффект) по периферии в виде каймы желто-зеленого цвета в люминесцентном микроскопе.
Недостаткомпрямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих антисывороток против каждого изучаемого антигена.
Непрямая РИФпроводитсяс использованием двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ против искомого антигена, а затем образовавшиеся комплексы АГ-АТ обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые антитела против гамма-глобулинов того вида животного, которого иммунизировали при получении немеченой сыворотки (например, антиглобулиновая кроличья сыворотка, содержащая антитела к глобулинам кролика).
Если немеченая антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов, то на втором этапе используют меченую антивидовую кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации кроличьими гамма-глобулинами ослов или каких-либо других животных.
Таким образом, необходимо иметь только антивидовую флюоресцирующую сыворотку.
При постановке непрямой РИФ:
1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся комплекс АГ-АТ (антитела покрывают антиген первым слоем);
2) обработка антивидовой меченной сывороткой 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С – антиглобулиновые меченные антитела связываются со специфическими антителами, которые служат для них антигенами (меченные АТ покрывают искомый АГ вторым слоем: АГ-АТ-АТ+флюорохром), вызывая свечение при люминесцентной микроскопии (т.е. АГ становится видимым в люминесцентном микроскопе).
Антикомплементарная РИФпредполагает применение меченых АТ против комплемента морской свинки. Для реакции используется комплемент, который фиксируется на комплексе антиген-антитело. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет увидеть АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.
При постановке РИФ с комплементом:
1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой и комлементом морской свинки 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся иммунный комплекс (АГ-АТ), на котором адсорбируется комплемент (АГ-АТ-комплемент);
2) обработка антикомплементарной меченной сывороткой (содержит антитела против глобулинов морской свинки) 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С - комплекс АГ-АТ-комплемент взаимодействует с флюоресцирующим антителом к комплементу и полученный многокомпонентный комплекс (АГ-АТ-комплемент-АТ+флюорохром) светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.
Необходимо иметь только одну флюоресцирующую сыворотку – антикомплементарную.
Достоинствомнепрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при обнаружении различных антигенов.Это значительно удешевляет реакцию. Но с другой стороны по мере усложнения процедуры РИФ возрастает и возможность ошибок. РИФ нельзя отнести и к числу высокочувствительных реакций. Не исключается возможность неспецифической адсорбции меченых АТ на препарате.
Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей (контроль с гетерологичным антигеном, контроль с неинфицированной культурой и т.д.). Применение лантаноидной метки (металлы лантаноидной группы) существенно повышает чувствительность метода.
Непрямой вариант РИФ можно использовать и для определения АТ в сыворотке больного. Для этого известный антиген (культура клеток, срезы тканей) наносят на предметное стекло и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам человека (антисыворотка к глобулинам человека). Этот метод используют для выявления антинуклеарных антител при аутоиммунных заболеваниях и антител к некоторым вирусам.
Задача № 3. Охарактеризовать иммуноферментный анализ (ИФА). Привести схемы постановки реакции для определения антигена и антитела.
Для этого надо знать:
Иммуноферментный анализ (ИФА) –выявление антигенов или антител с помощью антител, меченных ферментом. После присоединения этих антител добавляют субстрат данного фермента, который расщепляется с образованием продуктов, реагирующих с хромогенами, и наблюдается окрашивание раствора в желто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или в желто-зеленый цвет (при использовании фосфатазы). Конъюгированные с ферментом антитела сохраняют способность соединяться с гомологичным антигеном. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ-фермент. Возможность использования ферментов в качестве метки обусловлена их высокой каталитической активностью и специфичностью. ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний (ВИЧ-инфекции, гепатита А, В, С, Е).
В настоящее время чаще всего используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что на твердом материале сорбируют АГ или АТ, после чего добавляют остальные ингредиенты реакции. В качестве твердофазного носителя обычно используют пластиковые планшеты (шарики, пленки, пробирки), изготовленные из синтетических инертных материалов (полистерол, метакрил и др.) АГ или АТ в высушенном состоянии длительное время сохраняют свою специфичность и способность вступать в реакции.
Этапы определения неизвестных антигенов (прямой вариант – «сэндвич» -метод).
1) связывание специфичных антител с пластиком в лунках планшета;
2) внесение антигенсодержащего материала;
3) внесение антител той же специфичности, меченых ферментом пероксидазой;
4) добавление субстрата фермента с хромогеном (например, для пероксидазы субстратом является перекись водорода, а хромоген – 5 аминосалициловая кислота, ортофенилендиамин);
5) измерение количества окрашенных продуктов реакции.
Этапы определения неизвестных антител.
1) связывание известного антигена с пластиком в лунках планшета;
2) внесение исследуемой сыворотки;
3) внесение конъюгата – антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом (содержит антитела к глобулинам человека);
4) добавление субстрата фермента с хромогеном;
5) измерение количества окрашенных продуктов реакции.
Учет результатов. При «+» реакции изменяется цвет раствора. Интенсивность окрашивания пропорциональна активности фермента, а количество фермента, присоединенного к твердой фазе, соответствует количеству АГ или АТ. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью специального ФЭКа. Для проведения ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют СФ- регистратор экстинкции при длине волны 492 нм. Применяются также автоматические анализаторы (ридеры).
ИФА характеризуется высокой специфичностью и быстротой получения результатов (4-6 час). Стабильность конъюгатов позволяет их хранить в течение длительного времени. Измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне. Результаты можно оценить визуально(полуколичественно) без применения прибора. ИФА очень легко поддается автоматизации. Для повышение чувствительности ИФА необходимо использовать высокоспецифичные антитела (высокоаффинные моноклональные антитела).
Существует много методических вариантов ИФА. При непрямом варианте определения антигенов используют меченые ферментом антитела не той же специфичности, а антиглобулиновые (антивидовые – противочеловеческие) антитела. Опишите этапы постановки такого варианта определение антигенов при помощи ИФА и необходимые ингредиенты реакции. Разработаны так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммбилизованы или импрегнированны в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести образец и визуально наблюдать изменение окраски.
Задача № 4. Охарактеризовать радиоиммунный анализ (РИА) и иммуноблотинг.
Для этого надо знать:
Радиоиммунный анализ ( РИА).Основан на том же принципе, что и ИФА, только вместо фермента вносится радиоактивная метка. Радиоактивность определяют по счетчику импульсов. Применение РИА связано с использованием сложной регистрирующей аппаратуры, и существенной биологической и экологической опасностью.
Иммуноблотинг.При постановкеиммуноблотинга вначале препарат известного антигена фракционируют – разделяют методом электрофореза в агарозном геле на фракции (отдельные АГ). После этого гель накладывают на нитроцеллюлозную бумагу (фильтр), плотно прижимают к ней и создают электрическое поле, в результате происходит перенос фракций на бумагу (блоттинг). При этом сохраняется взаиморасположение фракций и их расстояние от старта (картина электрофореза). Далее обработку фильтра ведут также, как и при ИФА или РИА.
Учет результатов.Появлениеокрашивания фильтра в виде полос на тех местах, где располагались особые (специфические) фракции. АГ.
Вид фильтра после внесения хромогенного субстрата и окончательной промывки. 1 – отрицательный контроль, 2,4,5 – сыворотки больных, инфицированных вирусом простого герпеса -1 (ВПГ-1); 3,6 – сыворотки больных, инфицированных вирусом простого герпеса-2 (ВПГ-2).
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ И МИКРОБИОЛОГИИ
Е.Г. Доркина
ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Методические указания для самостоятельной внеаудиторной работы студентов 1-ого курса (очная форма обучения)
по дисциплине С2.Б.12 - микробиология
Пятигорск 2012
УДК 576. 8. 097 (076.5)
ББК 52.6 я 73
Д 68
Рецензент: зав. кафедрой биологии и физиологии, к.б.н. Л.Е. Назарова
Е.Г. Доркина
Д 68 Иммунодиагностические реакции: методические указания для самостоятельной внеаудиторной работы студентов 1-ого курса (очная форма обучения) по дисциплине С2.Б.12 – микробиология/ Е.Г. Доркина. – Пятигорск: Пятигорская ГФА. 2012. –30 с.
Методические указания составлены в соответствии с Примерной программой по микробиологии, утвержденной в соответствии с ФГОС ВПО-3 для студентов 1 курса очной формы обучения. Материал указаний содержит описание механизмов, особенностей и методов постановки основных иммунодиагностических реакций. Доступная форма изложения материала в сочетании с рисунками и таблицами поможет студентам в усвоении материала при подготовке к занятиям, подготовке домашних заданий и проведении самостоятельной работы на занятиях.
УДК 576. 8. 097 (076.5)
ББК 52.6 я 73
Допущено к внутривузовскому изданию
Председатель ЭМС
проф. _____________________ В.В. Гацан
Протокол № от « » 2012 г.
Ó Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2012
ВВЕДЕНИЕ
Для изучения данного раздела курса микробиологии программой предусмотрены 2 часа лекций и 4 часа лабораторных занятий.
Цель раздела.
Изучить механизмы, особенности и методы постановки различных иммунодиагностических реакций. Научить студентов использовать эти знания для идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.
Учебно-целевые вопросы.
Сущность реакций иммунитета. Получение диагностических сывороток. Реакция агглютинации и её разновидности; реакция преципитации и её разновидности (реакция кольцепреципитации, реакции преципитаций в геле, иммуноэлектрофорез); реакции лизиса (реакция гемолиза и бактериолиза); реакция связывания комплемента. Реакции иммунитета с меченными компонентами: РИФ, ИФА, РИА, иммуноблотинг. Реакция нейтрализации токсина антитоксином и реакция нейтрализации вирусов.
Занятие № 13
Тема: Реакции иммунитета: механизм, ингредиенты, способы постановки, учет результатов, практическое применение реакций агглютинации, преципитации и РСК (ПК-1, ПК-49).
Задачи для самоподготовки с алгоритмами решений.