Монтаж выделенных dCTPs в ПЦР-реакции

При установке Cy5-меченых dCTPs в ДНК-двойная стренга ПЦР-реакции

различные соотношения были использованы выделенные для немаркированных dCTPs. При

постоянной dGTP-, dTTP и dATP-концентрации 0,2 мм были в первом подходе

0,195 мм unmarkiertes dCTP и 0,005 мм Cy5-выделенный dCTP (коэффициент

1:40). В 2. Подход был использован метка соотношение 1:20 (0,19 мм dCTP + 0,01

мм Cy5-dCTP). 3. ПЦР-подход содержал 0,15 мм unmarkiertes dCTP и 0,05 мм

Cy5-выделенный dCTP (соотношение 1:4). Концентрация нуклеотидов мошенничества во всех так

Случаев 0,2 мм. При равномерной укладке dCTPs в первом подходе 40 каждый должен.

в 2. Подход каждый двадцатый и в 3. Каждый четвертый подход dCTP отметка носить.

Если исходить из G+C-зарплата от 30%, было бы все 250, все 125 или все 25 баз

один gelabeltes нуклеотида устанавливаться.

Эти теоретические соображения не могли быть подтверждены в эксперименте. В сервисе

Нуклеотид-Labelling-пропорции 1:40 или 1:20 были в 828 bp длинными Авива-PCR

Продукта или в 1197 bp длинными P936all_X1-PCR-продукта нет или максимум 1-2 отмеченные

dCTPs встроенный. Повышение Labelling соотношения 1:4 принес

Повышение эффективности Маркировки на 96-112 баз. Это значение находится позади, однако далеко

предполагаемой даты Label расстоянии 25 баз.

Метки геномной ДНК методом ник-Трансляции.

Геномная ДНК стартовых культур Probat 8/0, Probat 8/20 Probat и 8/21 был как

в 2.9.3 описанным методом ник-Трансляции с Cy5-dCTP отмечены. Затем был

Фермент и не встроенный dNTPs очистки Microcon-Фильтрация удаляет. Чтобы

такое искажение результата Отметка не оторвало Cy5-dCTPs

исключить, была Чистка после первого фотометрического определения

Метка эффективность неоднократно. Ставки на второго монтажного положения

обнаруженные отклонения положений с 1-5% колебания в пределах ширины

Meßungenauigkeit в Photometers или далеко под колебание ширины отдельных

Ник-Translations-Подходы.

Page 100

3. Результаты

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Отметка в 10 различных экспериментах средняя скорость Монтажа лежала в сервисе

Cy5-Label pro 39 баз. Разброс эффективности Маркировки следуют Гаусса

Распределение между 20 и 59 баз (20, 23, 23, 31, 34, 44, 47, 49, 58, 59).

Random geprimtes Labelling геномной ДНК с Cy5-dCTP.

Как у Nick-Translation установка Cy5 осуществляется через меченных dCTPs также здесь

Ферменты. Метка эффективность Random geprimten Labelling метод лежал в к

Nick-Translation сопоставимых порядков от 1 Label в среднем на 33 базах

после 2. Уборка. Монтажное ставки колебались от 1 Label pro 24 и 1 Label pro

41 оснований.

Рис. 30. Установка флуоресценции выделенных нуклеотидов в Nick-Translation, "random

primed labelling" или ПЦР.

Гибридизация меченых ДНК показал на микро массив только очень слабые

Сигналы. Несмотря на сравнительно высокую стоимость за реакцию ДНК заколебалась-

Концентрация 0,5-1,5 мкг ДНК для удовлетворительный результат Гибридизации.

Ник-TL

Random PCR

ПЦР 1:4

ПЦР 1:20

ПЦР 1:40

Fluo

Ropho

re

p

ро

N

u

k

ле

o

Tide

Page 101

4. Обсуждение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Обсуждение

4.1. Бактерии в популяции неустойчивы säuernden брожения

Прямое и культивации независимых in situ идентификация Молочных брожений

участвующие микроорганизмы новый способ обеспечивает контроль качества и

Безопасности продуктов в молочной промышленности. Впервые было показано, что метод

Флуоресцентная in situ- гибридизации целых клеток во время брожения один

Молочный продукт применим. Многочисленные примеры из других Экосистем, таких как

Грязи (Snaidr et al бодрит., 1997) или морских и limnischen водах (горбун et al.,

1999) доказывают работоспособности доказательства этой технологии (Amann et al., 1995).

На последовательности 16S и 23S рРНК оказалась подходящая цель для молекулы

быстрое, выращивание независимой идентификации микроорганизмов (Hugenholtz et al.,

1998; сталь и Amann, 1991). Специфичность зондов для выявления Lactococcus-

Подвид lactis (Betzl et al., 1990) и cremoris (Salama et al., 1993),

основные представители молочной кислоты относятся бактерии, был впервые на основе

Колонии экспериментах гибридизации показано. Beimfohr et al. зонды продолжали в рамках

FISH-экспериментов для идентификации вида Lactococcus, Streptococcus и

Enterococcus (Beimfohr et al., 1993). Возможные проблемы при Permeabilisierung

из грам-положительной клеточной стенки могут возникнуть, были в результате лечения Лизоцим

Преддверии гибридизации решена. Автомобильная флуоресценции от содержащегося в молочных продуктах

Белка могут быть сведены к минимуму путем промывки с помощью NaOH.

Использование иерархических зондов позволило, состав

Отслеживать популяции бактерий во время ферментации с мрачной расстройства. Которые

Разница клеточной цифры, которые с бактериями или групп-специфических зондов EUB338

и LGC354 было определить, лежит в рамках переписи nauigkeit (рис. 5). Это может

так что в сбраживаемой грамотрицательных микроорганизмов, как будут исключены

Salmonella typhimurium, Yersinia, энтеро ТОКСИЧНЫЙ E. coli (ETEC) и другие колиформы

Микробы, которые могут быть причастны & a. на вредоносную микрофлору творога, падение (Кремер,

1997).

Бактерии рода Lactococcus в самом начале брожения с 99,5% в

Брожения участвует (рис. 7). Самые подвид L. L. lactis, на протяжении всей

Брожения только макс. 6% бактерий приходится, скорее всего, подчиненную роль

играть. В отличие от этого, следует количество чем L. L. ssp. cremoris выявленных

Бактерии Periodik из мрачной кривой. До тех пор, пока рН сбраживаемой

Page 102

4. Обсуждение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

постоянно уменьшается, между 98 и 65% этих бактерий подвидов

сопоставляются. При рН 5,8 скисанием останавливается на короткое время и практически

нет L. l. ПВУ. cremoris больше не обнаруживается. Только при повторном окисление их берет

Количество снова. Из мрачной отказа так и к потере L. L. ssp. cremoris-

Популяция отнести.

Оба L. lactisподвид отличаются своими физиологическими особенностями.

В то время как L. L. ssp. lactis при 40°C, 4% NaCl или рН рН 9,2 не в росте

ограничено, показывает L. L. ssp. cremoris не растет. Способность аргинина для

гидролизуются также владеет только L. L. ssp. lactis и тем самым показывает более высокие общие

Допуск к колебаниям условий роста (Teuber et al., 1993). Ким et.

al. смогли показать, что L. L. ssp. cremoris гораздо более уязвимы на стресс реагирует как L. L. ssp.

lactis и менее хорошо за счет кислот, солей или холода, вызываемых стрессами настроить

может (Kim et al., 1999). Наличие фаги или их спасения также

есть стрессы являются фактором. В E. coli белок мог быть идентифицирован, то, аналогично

Теплового шока белка при повышенных температурах, при Возникновении фаги выражается

и по этой причине "фага shock" белка Psp Brisette et al называется (., 1990). Которые

Индукция осуществляется после заражения через нитевидные фаги, но и за счет тепла,

Этанол или осмотического стресса и не зависит от теплового шока-фактор σ32 (Кобаяси

et al., 1998; Weiner et al., 1991). Возможно, зависит от у L. L. ssp. lactis смотрел

высокая устойчивость против стресса с наличием таких стрессовых белков. Вы

позволяют ячейки быстрого реагирования на экстремальные условия роста или

Защиту против вирусов. Как на примере E. coli было показано, к

запрограммированную смерть клетки ведут, E. coli-фага λ путем так называемой экспрессии

"Anti Death" Белка Энгельберг-кулка и стекла, 1999) может помешать (. Поскольку

Функционирование фаги гены устойчивости типа "Абортивных Infection" в основном пока неизвестно

это может быть также фаги шок-белки. Этот тип

Фаги кажется резистентности в L. L. ssp. lactis гораздо более распространены, чем в L. L. ssp.

cremoris, поскольку только 2 из 18 Аби-генов в L. L. ssp. cremoris были идентифицированы ( см. 1.3.2 и

Ферде и Фицджеральд, 1999b).

Грамположительные бактерии с низким G+C содержание, как B. cereus и B. sphaericus,

Clostridium спец., Campylobacter спец., Enterococcus spec. или Listeria monocytogenes

не к роду Lactococcus принадлежат, но с LGC354-зонд обнаруживаются (Meier

et al., 1997), играть в начале окисление никакой роли. Доля этих

Организмы группы, которая в начальный культура, включенный рода Leuconostoc

Page 103

4. Обсуждение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

участвует, занимает только в процессе ферментации Бактерий приходится около 20%

(Рис. 7). РН сбраживаемой в этот период снижается с 6,0 до 5,3. Рассмотрены

можно в таб. 27 представленных рН - и температурные оптимумы бактерий, которые с

LowGC-зонд обнаруживаются, а не к роду Lactococcus относятся, как праздник,

что это с высокой вероятностью того, чтобы представители рода Leuconostoc действовать

скорее всего (яблони и шиллингер, 1993; Kraemer, 1997). Это рН-оптимум находится в

заданный диапазон и температурный оптимум соответствует условия Брожения

22-24°с. другие виды бактерий предпочитают более высокие температуры и, как правило,

более нейтральный рН. Положительные микроорганизмы бывают в пищу творог LowGC грам,

не в стартовой культуры, содержащиеся родов Lactococcus или Leuconostoc

принадлежат, так это в основном для термо-устойчивые споры ваятель, как B. cereus, B.

sphaericus или клостридии, о жар-обработанный, но не стерилизованное молоко в

Брожение попасть (Зиг Рик, 1996). Ее рН-оптимум также находится в слабокислой

Область.

Лек.

Mesente-

Roides

Bacillus

Spec.

Clostridium

Spec.

Campylo-

Bacter spec

Листерии

Monocyto-

Gjb

Staph

КОКК

Стафилококк

pH-оптимум

6,5-4,8

5,3-4,7

6,0-5,5

7,5-6,5

9,0-4,5

7,0-6,0

Температуры

optimum [°C]

22-28

28-35

30-40

42-45

30-37

35-37

Литература

(Хольцапфель

и

Шиллингер,

1993)

(Кремер,

1997)

(Кремер,

1997)

(Кремер,

1997)

(Кремер,

1997)

(Кремер,

1997)

Tab. 27. рН - и температурные оптимумы от LowGC грамположительных микроорганизмов.

Флуоресценцииin situ-гибридизации целых клеток обеспечивает большое преимущество, что для

Анализ состава Бактерий выращивания не требуется. Результаты

выращивание зависимые методы, такие как колонии-гибридизации сильно зависят от

Носитель, на котором бактерии будут притягиваться (Salama et al., 1993). Одновременное

Выращивания всех в сбраживаемой включенная родов, таких как Бактерии Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc и Streptococcus на носитель культуры

из-за разного роста требования не представляется возможным (Tsakalidou et al., 1994).

Descheemaeker et al. смогли на примере Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus и Vagococcus

показывают, что идентификация бактерий рода с помощью SDS-PAGE всего

Page 104

4. Обсуждение

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Клетки протеина можно Descheemaeker et al., (., 1994). Для этого, однако через служение

Выращивание изготовленные отдельных изолятов в качестве отправной точки. Это требование должно также

в другой классификации методов даны быть. Сюда относятся такие методы, как

Дифференциация Lactococcus-подвид с гистидин-PCR (Beimfohr et al., 1997) или

на основе лактат-Дегидрогеназы-филогения (Урбах et al., 1997). Basaran et al.

разработана на основе ПЦР метод, делеции в L. L. ssp. cremoris-геном для

Идентификация подвидов использует (Basaran et al., 2001).

В будущем выращивание независимый анализ бактериальной популяции можно в

Исходной культуры или для брожения образцы с помощью FISH протоку cytometrie

комбинировать и таким образом, достичь автоматизации (Fuchs et al., 1998). Bidnenko et

al. рыбу использовали для влияния на фаги проницаемость грамположительных

Для изучения клеточной стенки (Bidnenko et al., 1998). Вместо прямого флуоресцентного маркера

они использовали с пероксидазой хрена спаренных зондов, которые проникают только в клетку

можете, если через клеточную стенку или путем Автолиза фаги-кодированных энзимов

permeabilisiert было. FISH предлагает так с помощью выбранного подхода также

отныне интересные примеры применения.