Схема титрования фага по Аппельману

Таблица 13.2.

Ингредиенты, мл	Пробирки
опыт	контроль
										культуры	фага
Бульон (МПБ)	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5
Исследуемый фаг	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5 →	0,5	-	0,5
Культура м/о	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	-
	Разведение
10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10	-	10-1
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚C 18-20ч
Результат

Условные обозначения: + рост культуры, - отсутствие роста культуры.

Примечание. Стрелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. Из пробирки 10 и из пробирки контроля фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор.

4. Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробирки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с нестандартной пробиркой повторяют вновь.

5. Пробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат титрования. Учет результатов обязательно начинают с контролей.

При правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть размножение бактерий - содержимое пробирки становится мутным. Этот контроль позволяет сделать вывод, что взятая в опыт культура жизнеспособна и что питательная среда обеспечивает ее развитие в данных условиях опыта. Значит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

Жидкость в пробирке с контролем фага должна остаться прозрачной. Этот контроль позволяет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

При правильных результатах в контролях регистрируют характер изменений в первых десяти пробирках. Рост культуры в пробирках "опытного" ряда говорит об отсутствии или недостаточном количестве в них фага. Устанавливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое пробирки прозрачно). Обозначают титр степенью разведения фага с обратным знаком, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10^-7.

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20-25 мл МПА покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10^-1 до 10^-10 (как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45° С. В каждую из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в чашки Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18-20 ч. При большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: n = y×x, где n - искомое число; y - количество выросших на чашке колоний фага; x - разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10^-8 (1:10⁸) выросло 25 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 25×10⁸ или 2,5×10⁹частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага 10^-6 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320×10 или 3,2×10⁸ частиц фага. При разведении фага 10^-7 выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 4,2×10⁸/мл частиц фага. При разведении фага 10^-8 выросло 5 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5×10⁸/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1×10⁸.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчёта. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.

Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.

Методы выделения фагов

Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры.

Как правило, прямой метод не дает убедительных результатов из-за малого количества содержащегося в фильтрате фага. Для повышения его количества используют методы обогащения.

Метод обогащения. Подготовленный фильтрат вносят в 2-3-часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. Посев инкубируют в термостате. Фаг размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. После этого бульон фильтруют и в фильтрате определяют свойства и активность фага.