Сохранение биоразнообразия растений методом клонального микроразмножения

Глава 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ СОХРАНЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

На основе литературных данных рассмотрены два методических подхода к сохранению биоразнообразия растений: сохранение дикорастущих видов в естественных условиях (in situ) и искусственных (ex situ). Проанализирована возможность использования биотехнологических методов для сохранения и воспроизводства редких и исчезающих видов растений.

Рассмотрены теоретические основы культуры изолированных тканей, необходимые условия и возможные трудности на всех этапах клонального микроразмножения. Изучены факторы, влияющие на микроклональное размножение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro: генотипические особенности, физиологические факторы, состав питательной среды и условия культивирования.

Описаны наиболее представительные коллекции меристем редких и исчезающих видов растений in vitro. Проанализированы способы повышения эффективности содержания регенерантов в культуре in vitro на каждом этапе клонального микроразмножения.

Рассмотрена возможность и эффективность использования молекулярно-генетических маркеров для определения уровня генетического полиморфизма редких и исчезающих видов растений.

Метод биобаллистики –преимущества и недостатки. Примеры трасгенных растений.

Способы прямого введения генов в клетку

Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:

Трансфекция

Микроинъекция

Электропорация

Метод «мини-клеток»

Упаковка в липосомы

Электронная пушка

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3 - 10-5 клеток.

Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере).

В клетки можно вводить любой ген, если заранее лигировать его с клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования показали, что лигирование вне клетки не обязательно. Клетки, поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК, имеющуюся в кальциевом преципитате. Таким образом, пользуясь методом котрансформации, практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования кальциевого преципитата.

Для трансфекции можно использовать хромосомы или фрагменты хромосом. Клетки-доноры блокируются на стадии митоза. Митотические хромосомы высвобождаются под воздействием осмотического шока и гомогенизации. Их очищают путем дифференциального центрифугирования. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлористым кальцием, а через несколько часов обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны (например, глицерином).

Для обработки клеток-рецепиентов используются грубо очищенные препараты хромосом, так как хромосомы при этом разрушаются меньше всего. Количество хромосом для обработки 1 клетки ограничено. Лучше использовать не более 20 хромосом на 1 клетку-рецепиент, так как при высоких концентрациях хромосом в суспензии они агглютинируют. Рецепиентная клетка содержит фрагменты донорных хромосом, которые могут встраиваться в геном, могут реплицироваться самостоятельно. Во введенных фрагментах часто наблюдаются делеции.

Не все клетки способны к трансформации геномной ДНК с высокой частотой. Человеческие фибробласты эффективно включают плазмидную ДНК и почти не включают геномную.

Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора (рис. 45). Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322, были инъецированы в ТК--клетки и было показано, что ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Рис. 45. Введение ДНК путем микроинъекции

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки (рис. 46). Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.

Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2 кВ/см.

Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

введение ДНК в клетку путем электропорации

Рис. 46. Метод электропорации

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10-6 – 10-7.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно однодольных.

Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты. Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений, которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее время этим методом была проведена трансформация растений табака и после регенерации гаплоидных растений получены стабильные трансформанты.

65. Клеточная селекция растений - получение растений, устойчивых к засухе, засолению и к температурным условиям

Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

66. Направления научных исследований биотехнологии растений

1. Цитогенетические исследования растений.
2. Разработка стратегии применения генетических маркеров для ускорения и повышения эффективности селекции зерновых культур на примере тритикале и пшеницы.
3. Исследование межгеномных замещений и транслокаций на примере тритикале.
4. Изучение генетического разнообразия яровой тритикале и поиск генетических маркеров устойчивости к фузариозу колоса.
5. Создание библиотеки геномной ДНК Allium fistulosum на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC).
6. Исследование генетического контроля устойчивости к засухе у яровой тритикале.
7. Изучение мейотической рекомбинации у высших растений на примере томата.
8. Исследование самонесовместимости у растений.
9. Исследования по экспериментальному мутагенезу у растений.
10. Исследование генетического полиморфизма сельскохозяйственных и домашних животных.
11. Разработка биометрико-генетических методов для применения в селекции растений.
12. Исследование генетического контроля устойчивости к повышенным концентрациям солей алюминия
13. Изучение влияния генов короткостебельности на хозяйственно-ценные признаки у яровой тритикале.
14. Изучение генетического разнообразия и выявление эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине у тритикале.
15. Генетический анализ содержания белка в зерне у яровой тритикале.
16. Изучение генетической, экологической и онтогенетической изменчивости количественных признаков растений с целью обобщения результатов полевых опытов, в частности, для решения проблем экологического и государственного сортоиспытания.
17. Применение математического моделирования и компьютерных баз данных для оценки и сохранения внутривидового маркерного разнообразия, в частности по морфологическим признакам.
18. Сравнение и усовершенствование известных биометрико-генетических методов и параметров, используемых в генетике и селекции растений (оценки наследуемости и стабильности, диаллельный анализ, индексная селекция и т.д.).
19. Оценивание эффективности и оптимизация планов селекционно-генетических экспериментов (выбор: схем скрещиваний и отборов, размера выборок в поколениях, продолжительности эксперимента и т.п.).

67. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы - в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.). В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды. Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация - 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели. Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6. Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения. Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера. Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы. Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор. Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др. В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина - источник аминокислот. В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

68. Этапы и методы клонального микроразмножения.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2^оС, +10^оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регулято­ры роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использо­вания питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последую­щая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивиро­вание на агаризованной среде без гормонов или непосредствен­но в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

69. Методы трансформации и получение трансгенных растений.

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

70. Дифференциация и понятие, активные гены.Понятие «гены домашнего хозяйства» и « гены роскоши»

Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами — утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается «включением» разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных генов входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий.

«Гены домашнего хозяйства» (housekeeping genes) – это участки ДНК, кодирующие самые важные для клетки белки (например, необходимые для клеточного дыхания или синтеза аминокислот). Все эти гены представлены в ДНК большим количеством копий и экспрессируются постоянно во всех клетках организма. Точные механизмы активации этих генов оставаются малоизученными. Традиционно считалось, что что они регулируются координировано. Но недавно американские ученые, более пристально изучившие эти процессы, с удивлением обнаружили, что «включение» генов домашнего хозяйства происходит случайно. Это открытие может привести к пересмотру представлений о синхронизации клеточных процессов.

Гены «роскоши» (luxury genes) [греч. gen(os) — род, происхождение] — гены, обеспечивающие осуществление специализированных функций некоторыми типами клеток (напр., гены иммуноглобулинов в В-лимфоцитах или гены глобинов в эритроидных клетках); Г.«р.» противопоставляются генам «домашнего хозяйства»

71. Виды изменчивости в условиях in vitro и их использование в селекции

72. Центральная догма молекулярной биологии

обобщающее наблюдаемое в природе правило реализации генетической информации: информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении. Правило было сформулировано Френсисом Криком в 1958 году^[1] и приведено в соответствие с накопившимися к тому времени данными в 1970 году^[2]. Переход генетической информации последовательно от ДНК к РНК и затем от РНК к белку является универсальным для всех без исключения клеточных организмов, лежит в основе биосинтеза макромолекул. Репликации генома соответствует информационный переход ДНК → ДНК. В природе встречаются также переходы РНК → РНК и РНК → ДНК (например у некоторых вирусов), а также изменение конформации белков, передаваемое от молекулы к молекуле.

72. Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаемое в природе правило реализации генетической информации: информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении. Правило было сформулировано Френсисом Криком в 1958 годуи приведено в соответствие с накопившимися к тому времени данными в 1970 году. Переход генетической информации последовательно от ДНК к РНК и затем от РНК к белку является универсальным для всех без исключения клеточных организмов, лежит в основе биосинтеза макромолекул. Репликации генома соответствует информационный переход ДНК → ДНК. В природе встречаются также переходы РНК → РНК и РНК → ДНК (например у некоторых вирусов), а также изменение конформации белков, передаваемое от молекулы к молекуле.

73. Важность цитоплазматической наследственности для рстений

Под явлением цитоплазматической наследственности (ЦН) следует понимать наследование признаков и свойств организма, детерминированных элементами цитоплазмы и ее органоидами.

Основоположниками изучения цитоплазматической наследственности являются немецкие генетики К. Корренс и Э. Бауэр.

Прежде чем перейти к анализу фактов собственно цитоплазматической наследственности, необходимо, во-первых, установить соотношение роли ядра и цитоплазмы в наследственности и, во-вторых, рассмотреть ряд явлений, которые имитируют цитоплазматическую наследственность по своему проявлению, но не относятся к таковой: это случаи наследования через различные инфекции цитоплазмы, явления длительных модификаций и предетерминации цитоплазмы и др.

Для того чтобы взвесить значение отдельных элементов цитоплазмы в наследственности при половом размножении, необходимо, во-первых, определить те свойства, которыми они должны обладать, чтобы осуществлять функцию передачи информации от одного клеточного поколения к другому, во-вторых, определить те структуры цитоплазмы, которые обладают этими свойствами.

74. Ррастения, полученные с помощью генетической инженерии, их ценные признаки и площади их посевов в мире.

В 2002 году 75% всех выращиваемых трансгенных растений содержали ген устойчивости к гербицидам, 17% — ген устойчивости к вредителям и почти 8% — по два гена устойчивости. Но сегодня приоритеты в создании растений, обладающих теми или иными признаками, изменились. Если в 90-е годы в основном работали над растениями, обладающими полезными свойствами для их выращивания, — именно они сейчас и возделываются на полях, — то в настоящее время основной упор делается на улучшение потребительских свойств. По прогнозам, такие улучшенные культуры сменят растения, синтезирующие медикаменты, а их, в свою очередь, — растения-продуценты специфических химических соединений.

Генная инженерия растений развивается очень быстрыми темпами. Первое трансгенное, или генетически модифицированное, растение (ГМР) было получено в 1984 году, а через два года в США и во Франции уже проводились полевые испытания. Площади, занятые трансгенными растениями, стремительно возрастают: с 1,7 млн га в 1996 году, когда началось их возделывание в коммерческих масштабах, до 58,7 млн га в 2002 году, что составляло около 4,5% от всех пахотных площадей в мире. Причём 99% этой площади занимают четыре культуры: соя, хлопок, кукуруза и рапс. По этим растениям картина ещё более впечатляющая — в среднем 22% их насаждений занимают трансгенные сорта. В 2002 году в США около 75% хлопка и cои, в Аргентине — 99% сои, в Канаде — 65% рапса, в Китае — 51% хлопка были трансгенными.

75. Как осуществляется поиск нуклеотидной последовательности по базе данных, и какие программы поиска являются наиболее распространенными

GenBank

База данных нуклеотидных последовательностей из более чем 70,000 организмов (для кодирующих последовательностей приведена трансляция). GenBank-участник (вместе с EMBL и DDBJ) консорциума баз данных (базы данных обмениваются данными ежедневно и потому эквивалентны; описания и номера всех последовательностей одинаковы).

Доступ (получение последовательностей) через Entrez (поиск по названию, номеру, организму, автору и т.п.). Поиск по подобию осуществляется с помощью BLAST. Можно получить весь GenBank.

Для представления последовательностей в GenBank предложено два инструмента (перед отправкой полезно провести поиск векторных последовательностей с помощью VecScreen - инструмента, позволяющего идентифицировать в предложенной последовательности компоненты векторов, линкеров или адаптеров. Разработан для предотвращения загрязнения публичных баз данных векторами и т.п):

1. BankIt – www представление одной или нескольких последовательностей.
2. Sequin - www представление для длинных последовательностей, полных геномов, результатов популяционных и филогенетических исследований.

Разделы GenBank:

• ESTs - expressed sequence tags; короткие (300-500), просиквенированные один раз cDNA последовательности. Также включают последовательности cDNA из RACE и differential display экспериментов.
• GSSs - genome survey sequences; короткие, просиквенированные один раз геномные последовательности, exon trapped последовательности, cosmid/BAC/YAC концы и т.п.
• HTGs - high throughput genome sequences от крупных сиквенсовых центров. Незавершенные и завершенные последовательности.
• STSs - sequence tagged sites; короткие (200-500) последовательности, уникальные для данного генома. Используются для картирования геномов.