Вещества вторичного синтеза. Практическое применение суспензионной культуры.

Культура клеточных суспензий

Под суспензионными культурами понимают выращивание в жидкой среде отдельных клеток или небольших групп с использованием аппаратуры, обеспечивающей аэрацию и перемешивание.

Для получения суспензионных культур используют каллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещение ее в перемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивировании каллуса из среды исключают цитокинины или снижают их концентрацию, а увеличивают концентрацию ауксинов.

Наиболее простой принцип - накопление, периодическое культивирование суспензий. В этом случае размножение популяции клеток осуществляются в закрытой системе в постоянном объеме питательной среды. Обычно начальная плотность клеточной популяции составляет 0,5x105— 2,5х 1 о5 клеток на мл питательного раствора. Сосуды с суспензией закрепляют на платформе шейкера (встряхивателя) или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих условиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные Фрагменты. В лабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100—250 мл с небольшим объемом питательной среды - 20—70 мл. Крупномасштабное культивирование осуществляют в сосудах объемом до нескольких декалитров с продуванием жидкой среды стерильным воздухом.

Другие методы выращивания клеточных культур - непрерывное культивирование с поддержанием баланса между разбавлением питательной среды и удалением части суспензии. Было обнаружено, что если при накопительном культивировании клеточных суспензий в фазе логарифмического роста культуры в сосуд добавляют свежую среду, то деление клеток возможно поддерживать неограниченно долго. Это и послужило основой создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культивирование.

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную культуру непосредственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия.

Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной ткани.

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.

Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокининов, т.е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д

Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.

Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов.

При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы ферментов в периодическом или проточном режимах выращивания клеток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания, а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательная среда меняется на свежую. Как при периодическом, так и при проточном режимах выращивания в открытой системе клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене.

Однако в открытых системах культивирования при замене питательной среды (периодическом или непрерывном) вместе со средой отбирается и часть суспензионных клеток.

Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность плотность клеток в суспензионной культуре, степень агрегированности, скорость роста.

Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.

Одним из основных показателей, характеризующих состояние клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетной камере Фукса—Ро-зенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток). В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту (10—20 %-ная), которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки.

Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, s-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14—16 дней. При этом плотность возрастает от 5* 104 до 5*106 кл/мл.

Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциальной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы — основные критерии роста суспензионных культур.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэтому, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.

Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20 000 и более литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Наиболее распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. Для аэрации и перемешивания суспензии используют качалки, роллеры, ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.

Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также новые необычные соединения, например, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.

Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.

Непрерывные культуральные системы подразделяют на полу проточные и проточные.

Полупроточный режим выращивания

При этом производится отбор определенной части клеточной суспензии через интервалы времени и разбавление оставшейся части суспензии свежей средой. Через суспензию пропускают стерильный воздух. Культуру размешивают магнитной мешалкой. Культивирование может продолжаться в течение нескольких месяцев.

Проточный режим выращивания

При этом осуществляется непрерывное снабжение свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, используемые для производства больших клеточных масс, могут иметь объем до 1500 л.

Кроме того, разрабатываются конструкции, состоящие из системы нескольких ферментеров, что создает возможность осуществлять многостадийный процесс при промышленном культивировании клеток-продуцентов веществ вторичного обмена.

Практическое использование культуры клеточных суспензий: для изучения дифференциации клеток, их биосистематических особенностей и популяционных взаимоотношений; для промышленного получения необходимых продуктов клеточного метаболизма.



Требования, предъявляемые к векторам генетической инженерии растений

К векторам предъявляются определенные требования. Кольцевая молекула ДНК может реплицироваться в клетках, если содержит ДНК-репликатор (оri-последовательность). Вектор должен содержать уникальные сайты рестрикации для нескольких рестриктаз, обладать определенной емкостью и не выбрасывать встроенный фрагмент; маркерный ген, облегчающий отбор клеток, несущих вектор, чтобы ген экспрессировался (получался продукт, синтезированный по информации введенного гена); специфические для данной клетки промоторы и терминаторы («стоп»-кодоны) транскрипции.