Реакции с меченными компонентами.

В настоящее время широко применяются серологическиереакции с меченными тем или иным способом компонентами (антителами – АТ или антигенами – АГ). Они отличаются высокой специфичностью, позволяют быстро получить результаты, поэтому используются для экспресс-диагностикивирусных и бактериальных инфекций. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции – РИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, радиоиммунный анализ –РИА.

В качестве меток используются:

1) флюорохромы – вещества, способные флюоресцировать при облучении ультрафиолетом (поглощают энергию света определенной длины волны и излучают свет большей длины волны): флюоресцеина изотиоцианат (зеленый цвет), фикоэритрин (оранжевый), родамин (красный); используются в РИФ;

2) ферменты:пероксидаза хрена, галактозидаза, щелочная фосфатаза; вызывают расщепление субстрата с образованием окрашенных продуктов при взаимодействии с хромогеном; используются для ИФА;

3) радиоактивные метки –используютсяв РИА.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), ее разновидности, постановка и применение.

РИФ(реакция Кунса) – основана на том, что антигены тканей или микроорганизмы после обработки иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах, что обнаруживается при люминесцентной микроскопии мазков. Т.о. обязательно используется люминесцентная микроскопия (т.е. данный метод является разновидностью микроскопического метода диагностики). Использование флюорохромов основано на том, что они способны вступать в химическую связь с антителами, не нарушая их иммунологической специфичности. Метод позволяет обнаружить микроорганизмы непосредственно в инфекционном материале, тканях животных и культурах клеток. Простота метода, не требующего выделения чистой культуры в сочетании с быстротой получения результатов, позволяют отнести РИФ в разряд экспресс-диагностики.

Различают 3 основные разновидности метода: 1) прямой; 2) непрямой; 3) непрямой с комплементом (антикомплементарная РИФ).

Прямая РИФ. Компоненты (ингридиенты).

1. Антигены тканей или микроорганизмы.

2. Флюоресцирующая (люминесцирующая) иммунная антисыворотка – содержит известные антитела (против искомого антигена), меченные флюорохромами.

Антигенами могут быть культуры бактерий, грибов, простейших; препараты из материала от больных (кал при холере, мокрота при коколюше); инфицированные культуры клеток, срезы тканей.

Постановка реакции.

1. Исследуемый материал наносят на предметное стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне, 10 мин, при комн. t⁰), высушивают 20 мин, 37⁰С.

2. На фиксированный мазок наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические антитела, меченные изотиоцианатом, 30 мин, 25⁰С (во влажной камере).

3. Промывка буферным раствором, 10 мин, 25⁰С.

4. Люминесцентная микроскопия: сначала при 40х, а затем – 90х (обращают внимание не только на наличие свечения, но и его интенсивность, характер распределения).

Учет реакции. «+» реакция –клеткисветятся (видимый эффект) по периферии в виде каймы желто-зеленого цвета в люминесцентном микроскопе.

Недостаткомпрямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих антисывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямая РИФпроводитсяс использованием двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ против искомого антигена, а затем образовавшиеся комплексы АГ-АТ обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые антитела против гамма-глобулинов того вида животного, которого иммунизировали при получении немеченой сыворотки (например, антиглобулиновая кроличья сыворотка, содержащая антитела к глобулинам кролика).

Если немеченая антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов, то на втором этапе используют меченую антивидовую кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации кроличьими гамма-глобулинами ослов или каких-либо других животных.

Таким образом, необходимо иметь только антивидовую флюоресцирующую сыворотку.

При постановке непрямой РИФ:

1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой 30 мин, 25⁰С и промывка 10 мин, 25⁰С – образуется несветящийся комплекс АГ-АТ (антитела покрывают антиген первым слоем);

2) обработка антивидовой меченной сывороткой 30 мин, 25⁰С, промывка 10 мин, 25⁰С – антиглобулиновые меченные антитела связываются со специфическими антителами, которые служат для них антигенами (меченные АТ покрывают искомый АГ вторым слоем: АГ-АТ-АТ+флюорохром), вызывая свечение при люминесцентной микроскопии (т.е. АГ становится видимым в люминесцентном микроскопе).

Антикомплементарная РИФпредполагает применение меченых АТ против комплемента морской свинки. Для реакции используется комплемент, который фиксируется на комплексе антиген-антитело. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет увидеть АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.

При постановке РИФ с комплементом:

1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой и комлементом морской свинки 30 мин, 25⁰С и промывка 10 мин, 25⁰С – образуется несветящийся иммунный комплекс (АГ-АТ), на котором адсорбируется комплемент (АГ-АТ-комплемент);

2) обработка антикомплементарной меченной сывороткой (содержит антитела против глобулинов морской свинки) 30 мин, 25⁰С, промывка 10 мин, 25⁰С - комплекс АГ-АТ-комплемент взаимодействует с флюоресцирующим антителом к комплементу и полученный многокомпонентный комплекс (АГ-АТ-комплемент-АТ+флюорохром) светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Необходимо иметь только одну флюоресцирующую сыворотку – антикомплементарную.

Достоинствомнепрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при обнаружении различных антигенов.Это значительно удешевляет реакцию. Но с другой стороны по мере усложнения процедуры РИФ возрастает и возможность ошибок. РИФ нельзя отнести и к числу высокочувствительных реакций. Не исключается возможность неспецифической адсорбции меченых АТ на препарате.

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей (контроль с гетерологичным антигеном, контроль с неинфицированной культурой и т.д.). Применение лантаноидной метки (металлы лантаноидной группы) существенно повышает чувствительность метода.

Непрямой вариант РИФ можно использовать и для определения АТ в сыворотке больного. Для этого известный антиген (культура клеток, срезы тканей) наносят на предметное стекло и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам человека (антисыворотка к глобулинам человека). Этот метод используют для выявления антинуклеарных антител при аутоиммунных заболеваниях и антител к некоторым вирусам.

8. Иммуноферментный анализ (ИФА). Схемы постановки реакции для определения антигена и антитела.

Иммуноферментный анализ (ИФА) –выявление антигенов или антител с помощью антител, меченных ферментом. После присоединения этих антител добавляют субстрат данного фермента, который расщепляется с образованием продуктов, реагирующих с хромогенами, и наблюдается окрашивание раствора в желто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или в желто-зеленый цвет (при использовании фосфатазы). Конъюгированные с ферментом антитела сохраняют способность соединяться с гомологичным антигеном. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ-фермент. Возможность использования ферментов в качестве метки обусловлена их высокой каталитической активностью и специфичностью. ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний (ВИЧ-инфекции, гепатита А, В, С, Е).

В настоящее время чаще всего используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что на твердом материале сорбируют АГ или АТ, после чего добавляют остальные ингредиенты реакции. В качестве твердофазного носителя обычно используют пластиковые планшеты (шарики, пленки, пробирки), изготовленные из синтетических инертных материалов (полистерол, метакрил и др.) АГ или АТ в высушенном состоянии длительное время сохраняют свою специфичность и способность вступать в реакции.

Этапы определения неизвестных антигенов (прямой вариант – «сэндвич» -метод).

1) связывание специфичных антител с пластиком в лунках планшета;

2) внесение антигенсодержащего материала;

3) внесение антител той же специфичности, меченых ферментом пероксидазой;

4) добавление субстрата фермента с хромогеном (например, для пероксидазы субстратом является перекись водорода, а хромоген – 5 аминосалициловая кислота, ортофенилендиамин);

5) измерение количества окрашенных продуктов реакции.

Этапы определения неизвестных антител.

1) связывание известного антигена с пластиком в лунках планшета;

2) внесение исследуемой сыворотки;

3) внесение конъюгата – антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом (содержит антитела к глобулинам человека);

4) добавление субстрата фермента с хромогеном;

5) измерение количества окрашенных продуктов реакции.

Учет результатов. При «+» реакции изменяется цвет раствора. Интенсивность окрашивания пропорциональна активности фермента, а количество фермента, присоединенного к твердой фазе, соответствует количеству АГ или АТ. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью специального ФЭКа. Для проведения ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют СФ- регистратор экстинкции при длине волны 492 нм. Применяются также автоматические анализаторы (ридеры).

ИФА характеризуется высокой специфичностью и быстротой получения результатов (4-6 час). Стабильность конъюгатов позволяет их хранить в течение длительного времени. Измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне. Результаты можно оценить визуально(полуколичественно) без применения прибора. ИФА очень легко поддается автоматизации. Для повышение чувствительности ИФА необходимо использовать высокоспецифичные антитела (высокоаффинные моноклональные антитела).

Существует много методических вариантов ИФА. При непрямом варианте определения антигенов используют меченые ферментом антитела не той же специфичности, а антиглобулиновые (антивидовые – противочеловеческие) антитела. Опишите этапы постановки такого варианта определение антигенов при помощи ИФА и необходимые ингредиенты реакции. Разработаны так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммбилизованы или импрегнированны в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести образец и визуально наблюдать изменение окраски.

Радиоиммунный анализ (РИА) и иммуноблотинг.

Радиоиммунный анализ ( РИА).Основан на том же принципе, что и ИФА, только вместо фермента вносится радиоактивная метка. Радиоактивность определяют по счетчику импульсов. Применение РИА связано с использованием сложной регистрирующей аппаратуры, и существенной биологической и экологической опасностью.

Иммуноблотинг.При постановкеиммуноблотинга вначале препарат известного антигена фракционируют – разделяют методом электрофореза в агарозном геле на фракции (отдельные АГ). После этого гель накладывают на нитроцеллюлозную бумагу (фильтр), плотно прижимают к ней и создают электрическое поле, в результате происходит перенос фракций на бумагу (блоттинг). При этом сохраняется взаиморасположение фракций и их расстояние от старта (картина электрофореза). Далее обработку фильтра ведут также, как и при ИФА или РИА.

Учет результатов.Появлениеокрашивания фильтра в виде полос на тех местах, где располагались особые (специфические) фракции. АГ.

Вид фильтра после внесения хромогенного субстрата и окончательной промывки. 1 – отрицательный контроль, 2,4,5 – сыворотки больных, инфицированных вирусом простого герпеса -1 (ВПГ-1); 3,6 – сыворотки больных, инфицированных вирусом простого герпеса-2 (ВПГ-2).