Тема 9. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ
Контрольные вопросы
1. Понятие о колонии микроорганизмов; характер колоний.
2. Понятие о чистой культуре, методы ее получения.
3. Протеолитические, сахаролитические и окислительно-восстановительные свойства микробов; методы их изучения.
4. Ферменты микробов: природа, свойства, основные группы.
5. Морфологические, культуральные и биохимические свойства кишечной и сенной палочки.
6. Использование методов выделения и изучения чистых культур микробов в народном хозяйстве.
7. Методика получения и изучения чистой культуры микробов.
Занятие 1.Выращивание изолированных колоний.
Оборудование
1. Две чистые культуры: кишечная, сенная палочки.
2. МПА и среда Эндо в чашках Петри (по одной).
3. Стерильные шпатели, пробирки, пипетки, вода.
Методические указания
В природе и организме человека или животного микробы находятся в сложных взаимоотношениях и составляют ценозы – сообщества. Чтобы изучить какой либо один или несколько обитающих в природе видов, нужно сначала получить его чистую культуру, то есть выращенную из одной микробной клетки отдельно от других видов. Изолировать микробную клетку удается разнообразными методами:
- механическим разобщением на агаровых пластинах, когда минимальное количество исследуемого субстрата растирают на поверхности плотной питательной среды;
- предельным разбавлением стерильной водой или питательной средой и дальнейшим выращиванием;
- микроманипулятором (с использованием микроскопа).
На плотной питательной среде вырастает колония, т.е. скопление потомства микроорганизмов одного вида, выросшее из одной бактериальной клетки. В дальнейшем из этих колоний получают чистые культуры, которые тщательно исследуют и используют.
Ход работы
1. В стерильной пробирке с 0,5 мл дистиллированной воды приготовить смешанную суспензию из двух культур.
2. Приготовить мазок из суспензии, окрасить по Граму и, исследуя под микроскопом, отметить морфологию, отношение к окраски по Граму и приблизительное соотношение видов. Зарисовать картину.
3. Произвести посев суспензии для получения изолированных колоний микробов. Посев осуществляют двумя способами:
- шпателем (шпатель – изогнутая под прямым углом палочка);
- последовательной штриховкой.
Для посева шпателем обожженной бактериологической петлей на поверхность среды наносят мельчайшую капельку суспензии, затем в чашку Петри вводят шпатель и тщательно растирают суспензию по всей поверхности среды.
При посеве последовательной штриховкой небольшое количество суспензии распределяют петлей по всей поверхности среды параллельными штрихами на расстоянии 0,5 см друг от друга, удерживая петлю плашмя, чтобы не нарушить целостность агара. При этих способах посева чашку лишь приоткрывают большим и указательным пальцами левой руки.
4. Засеянные среды этикетировать и поместить в термостат при температуре 35-370С. Через 24-48 часов на средах вырастают колонии.
Занятие 2. Изучение колоний и получение чистых культур.
Оборудование
1. Питательные среды с посевами предыдущего занятия.
2. МПА и среда Эндо в пробирках (по одной на стол).
Методические указания
В засеянных чашках необходимо выявить отдельно выросшие колонии, отличающиеся по внешнему виду. Для этого просматривают чашки со дна в проходящем свете. Отмечают величину колонии (крупные – диаметр 1 см, средние – от 1мм до 1 см, мелкие – меньше 1мм), форму (круглые, вогнутые, с возвышением или углублением в центре, с ровными или изрезанными краями), характер поверхности (плоские, выпуклые, шероховатые, морщинистые, гладкие), цвет и прозрачность. более четкое строение колонии выявляют под микроскопом при малом увеличении (х8), при суженой диафрагме и опущенном конденсоре. Чашку для этого помещают на предметном столике дном вверх. Представляющие интерес колонии отмечают восковым карандашом. Чтобы получить чистые культуры, из изученных колоний делают пересевы на скошенные среды. В окрашенных по Граму мазках изучают морфологию микроорганизмов. Пересев производят в ниже приведенной последовательности:
чашку с посевом помещают на стол дном вверх;
в правую руку берут петлю и обжигают;
левой рукой поднимают дно чашки Петри, касаются петлей намеченной колонии и закрывают чашку;
в левую руку берут пробирку со скошенной средой и делают пересев, и размазывают микроорганизмы по поверхности среды.
Ход работы
1. Изучают посевы предыдущего занятия и отмечают колонии, предположительно относящиеся к сенной и кишечной палочкам.
Характеристику колоний вносят в таблицу, начерченную на отдельном листе тетради. Зарисовывают колонию в тетрадь.
2. Делают пересев из отмеченных колоний на МПА (сенную палочку) и среду Эндо (кишечную палочку). На пробирках делают обозначения.
3. Из этих колоний готовят мазок, окрашивают по Граму. Морфологические свойства заносят в таблицу.