Порядок идентификации вирусов болезни Ньюкасла и гриппа птиц в РТГА

1 Разведение эталонных стандартных антигенов и антигенов сывороток согласно на­ставлению.

2 Титрование аллантоисной жидкости и стандартных антигенов в ТРГА с эритроцитами кур, определение титра и разведение их до 4АЕ в 0,2 мл физиологического раствора.

3 Постановка РТГА с аллантоисной жидкостью и стандартными антигенами виру­сов болезни Ньюкасла и гриппа птиц согласно схемы.

4 Учет результатов.

Контрольные вопросы:

1 Структура вируса болезни Ньюкасла.

2 Структура вируса гриппа птиц.

3 Как протекает болезнь Ньюкасла и грипп птиц и кур?

4 Какой патологический материал направляют в лабораторию для диагностического исследования?

Раздел 3 Современные методы диагностики инфекционных болезней

Тема: Иммуноферментный анализ (ИФА)

Цель: Ознакомиться с иммуноферментным анализом для диагностики инфекционных болезней.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – это современный метод, позволяющий с высокой эффективностью выявлять в сыворотках больных животных и людей специфические антигены или антитела к ним. Метод широко используется при диагностике вирусных и бактериальных инфекций.

Принцип иммуноферментного анализа заключается в соединении комплекса «антиген-антитело» с конъюгатом, содержащим ферментную метку, выявляемую с помощью субстратной смеси.

Иммуноферментный анализ применяется для выявления:

● специфических антител

● антигена возбудителя

● суммарных антител

Иммуноферментный анализ применяется для выявления наличия в сыворотке крови специфических иммуноглобулинов (Ig или антител) - белков, вырабатываемых клетками иммунной системы, направленным агентом. Связываясь с микробной клеткой или продуктами ее жизнедеятельности, иммуноглобулины нейтрализуют их и способность их элиминации. Таким образом, иммуноглобулины представляют собой суть гуморального иммунитета. На каждый вид (и даже подвид) возбудителя вырабатываются свои определенные антитела, которые, не связываются ни с каким другим инфекционным агентом. Благодаря этому определение антимикробных антител обеспечивает достаточно высокую специфичность анализа. Из пяти классов Ig в диагностике инфекционных заболеваний чаще всего используются Ig трех типов А, М и G.

Выработка иммуноглобулинов происходит по определенным законам: существует некоторый промежуток времени с момента внедрения инфекционного агента в организм и до момента появления антител в сыворотке крови – это так называемый серонегативный период. Для различных инфекций и отдельных индивидуумов он может быть неодинаков.

В первую очередь начинают вырабатываться IgМ, пик которых приходится на максимум проявлений клинических признаков острой инфекции. Поэтому IgМ принято считать маркером острой фазы заболевания. С отставанием на 1-2 недели начинает увеличиваться титр IgG. В последующем содержание IgМ в сыворотке крови снижается, а IgG - продолжает увеличиваться. Этот период соответствует стадии перехода инфекций из острой фазы в хроническую инфекцию. Если в какой-то момент происходит обострение хронической инфекции, то наблюдается новый всплеск IgМ, с последующим увеличением титра IgG соответствующим фазе ремиссии. Если организм справляется с инфекцией (сам или с помощью медикаментов), то IgG могут еще длительное время (а для некоторых инфекций и пожизненно) оставаться повышенными.

В настоящее время в нашей стране ИФА-тест-системы разрабатываются по трём схемам проведения реакции.

В основе первой схемы (метод двойного связывания) лежитследующее: на твёрдофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) зафиксирован антиген возбудителя, который инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии антител в материале пациентов происходит их связывание в комплекс «антиген-антитело» (I фаза реакции).

После завершения первой реакции планшет отмывается. При этом не связывавшиеся компоненты исследуемой пробы удаляются, а на стенках лунок остается комплекс антиген-антитело. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологическую реакцию, в которой в качестве антигена выступает связавшийся специфической Ig, а в качестве антител к нему- коньюгат, представляющий собой Ig (например, кроличий) к соответствующему Ig человека, меченный ферментом (обычно пероксидазой) (II фаза реакции).

После завершения второй иммунологической реакции следует отмывка лунок планшета от избытка конъюгата и далее – третий этап – ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы коньюгата. Субстратом данной реакции служит бесцветное вещество- хромоген (орто-фенилендиамин, ОФД или тетраметилбензидин, ТМБ), который в ходе реакции образует окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке определенным образом зависит от количества антител содержащихся в пробе. После остановки ферментативной реакции проводят фотометрирование лунок. Далее с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. В общем случае, чем выше оптическая плотность в данной лунке, тем большее количество специфических антител содержалось в соответствующей пробе и, следовательно, выше титр анализируемой сыворотки. При отсутствии в сыворотке исследуемых антител лунки остаются неокрашенными.

Вторая схема: ИФА с фиксированными антителами или «ловушка для антител». Здесь на твердофазном носителе фиксируются аффинно-очищенные антитела против определенного класса иммуноглобулинов (М, G или А), которые связывают находящиеся в испытуемых сыворотках крови иммуноглобулины соответствующего класс аза реакции). Образование комплекса «антитело – специфический иммуноглобулин» выявляют с помощью конъюгата (II фаза). При инкубации с субстратом (IIIфаза) в случае наличия иммуноглобулинов соответствующего класса в испытуемой сыворотке или плазме крови наступает окрашивание раствора.

Третья схема: ИФА используется для выявления суммарных антител, специфических для определенного антигена, независимо от их класса. Её суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченым ферментом, при совместной инкубации сыворотки крови и конъюгата (I фаза реакции). Наличие образовавшегося комплекса определяют с помощью субстрата (II фаза).

В зависимости от используемых антигенов все ИФА- тест – системы для выявления антител подразделяются:

● лизатные – в качестве антигена, иммобилизованного на твердой фазе или входящего в состав конъюгата, используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре):

● рекомбинантные – в качестве антигена используются полученные генно-инженерным способом белки- аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;

● пептидные – использующие синтетические фрагменты белков.

Подготовка образцов

Рекомендуемое приготовление сыворотки: отстаивание 0,5-1 час при 37⁰С в термостате для быстрого формирования фибринового сгустка (не превратившийся в фибрин фибриноген является источником ложнопозитивных реакций во многих тест-системах), центрифугирование 10 минут при 3000 об/мин или 20 мин при 1500 об/мин.

При приготовлении сывороток должны быть приняты все меры, позволяющие исключить контаминацию. Если в тест-системе используются компоненты, полученные из крови человека, то к таким компонентам следует относиться как к потенциально инфекционным независимо от результатов тестов, которые провел производитель тест-системы. При работе с компонентами набора и исследуемыми образцами работать только в перчатках. По окончании работы обязательно тщательно вымыть руки. Все исследуемые образцы следует считать потенциально инфекционными. При работе с таблетками ОФД следует использовать только пластиковые пинцеты или пинцеты с пластиковым покрытием, так как ОФД может реагировать с металлами, что может привести к неправильным результатам.Попадание ОФД в глаза, на кожу или одежду может привести к раздражению или аллергической реакции. В случае попадания ОФД на кожу следует промыть место контакта большим количеством воды. ОФД является свето и влагочувствительным. Флакон с ОФД следует хранить плотно закрытым. Перед тем, как открыть флакон с ОФД следует довести его до комнатной температуры во избежание конденсации влаги внутри флакона. Не следует использовать сломанные таблетки ОФД.

Для приготовления реагентов следует использовать дистиллированную или деионизированную воду. Эту воду следует хранить в неметаллических емкостях.

Не следует использовать реагенты из разных серий тест-системы.

Все реагенты и компоненты тест-системы должны быть доведены перед использованием до комнатной температуры, а после работы должны храниться при температуре от 2 до 8⁰С. При дробном использовании набора следует сократить до минимума нахождение растворов при комнатной температуре и особенно в открытой посуде. Если производитель использует осушитель, меняющий цвет при насыщении влагой (наиболее распространена смена цвета с синего на розовый), запрещается использовать планшет в случае достижения осушителем «неправильного» цвета. Не следует использовать реагенты позднее указанного срока годности. Следует предпринять все меры для предотвращения возможного перепутывания или перемешивания реагентов (например, использовать только специально предназначенные и подписанные емкости для приготовления реагентов). Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны. Планшеты (стрипы) можно использовать для постановки ИФА только один раз. Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной температуре примерно 30 минут для предотвращения конденсации влаги на планшете. Если планшет разборный, и используются не все стрипы сразу, то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, который необходимо закрыть. Распространенный способ – край пакета сворачивается вдвое и зажимается скрепками. Зарубежные фирмы вкладывают в наборы специальные зажимы для этих целей, эти зажимы можно использовать и для укупорки пакетов с планшетами отечественных производителей. Не следует удалять пакетик с влагопоглотителем. Следует убедиться в том, что исследуемый образец или реагент внесен в лунку. При использовании одноканальной пипетки для внесения испытуемых образцов необходимо использовать новый наконечник для каждого образца. При использовании многоканальной пипетки следует использовать новые наконечники для каждого используемого реагента. Реакция связывания антител с антигенами начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно, по - возможности, уменьшить период между внесением первой и последней сывороток на планшет. В случае длительного времени образцов (например, постановка цельного планшета) рекомендуется перестановка сывороток, дающих оптическую плотность в ближайшем к серой зоне районе оптических плотностей.

Если допущена ошибка при внесении анализируемых образцов (например, 2 сыворотки внесены в одну лунку), нельзя, опорожнив эту лунку, вносить в нее новый образец. Такая лунка бракуется. Не следует допускать подсыхания лунок в период между инкубациями или промывками – возможно образование плохорастворимой пленки на их поверхности. В случае необходимости длительного перерыва следует положить планшет вверх донышками лунок на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу, в норме – не допускать длительного перерыва. Не следует касаться дна лунок – отпечатки пальцев или перчаток могут привести к неправильной регистрации оптической плотности.

При использовании стрипов следует работать с обязательной фиксацией стрипов в рамке. Следует осторожно протереть донышки лунок с помощью мягкой, не оставляющей волокон салфетки (при наличии на донышках капель влаги, пылинок и других загрязнений) до регистрации оптической плотности.

В случае получения оптической плотности от контрольных образцов, не попадающей в интервал, описанный в соответствующем разделе инструкции, следует считать, что имеются ошибки при подготовке или постановке реакции, либо тест-система непригодна к применению. Если используется ридер без калибровочного фильтра на 620-630 нм, следует учитывать возможность того, что мутные или загрязненные области планшета могут быть зарегистрированы с завышенным значением реальной оптической плотности. Если производитель не упоминает в инструкции об использовании калибровочного фильтра, то следует учитывать возможность сдвига ОП крит при некоторых формулах расчета в случае вычета оптической плотности на длине волны калибровочного фильтра (например, если при формуле ОП крит= ОПК- + 0,2 вычет оптической плотности на длине волны калибровочного фильтра практически не влияет на интерпретацию результатов, так как при незагрязненных донышках от всех значений оптической плотности исследуемых образцов и К- отнимается примерно одно и то же число и разница между оптикой К- и исследуемым образцом практически не изменяется, то при формуле ОП крит= ОП К-х 3 при малых значениях ОПК- можно достаточно далеко отойти от результата, планируемого производителем, так как от исследуемого образца оптическая плотность на длине волны калибровочного фильтра отнимается один раз, а от ОП крит отнимается фактически 3 раза). Необходимо сличать полученную распечатку оптической плотности лунок с визуальной оценкой. Возможны искажения реальной оптической плотности в результате попаданий соринок в лунку или загрязнений донышка лунки.

Особенности работы:

Необходимо выделить отдельную посуду и наконечники для работы с раствором конъюгата. Идеальный вариант- использование посуды и наконечников однократного применения. В реальной жизни часто не имеется такой возможности. Если посуда и наконечники используются многократно, то при подборе схемы мойки должно быть учтено сильное влияние даже следовых количеств таких веществ, как перекись водорода, хлорамин, азид натрия или добавки в синтетические моющие средства, на активность конъюгата. Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением. Равномерность заполнения и опорожнения всех лунок планшета контролируют, как правило, визуально в процессе промывки.

В идеале – перед промывкой содержимое лунок отсасывается пипеткой затем при промывке лунки заполняются до самого верха. При таком способе промывки резко падает вероятность появления неправильных результатов, связанных с загрязнением боковых поверхностей лунок растворами сывороток или конъюгата. Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.

Для работы с раствором ОФД рекомендуется выделить отдельную посуду, которую нужно каждый раз ополаскивать 50%-ным раствором спирта и затем дистиллированной водой. Запрещается мыть посуду для ОФД растворами синтетических моющих средств.

Также желательно выделить отдельные наконечники для пипеток, которые будут применяться только для работы с раствором ОФД. Сразу после использования рекомендуется промывать такие наконечники спиртом и дистиллированной водой. Отбор концентрата ТМБ проводить только новыми наконечниками. Не использовать посуду и наконечники для отбора раствора ТМБ в ЦФР, если они ранее применялись для растворов ОФД, так как даже следовые количества ОФД приводят к неправильным результатам.

Составы ЦФР для ТМБ и ОФД различны, поэтому нельзя использовать для разведения ТМБ ЦФР из наборов с комплектацией таблетками ОФД и наоборот.

В тест-системах с комплектацией ТМБ нельзя использовать комплект ЦФР-ОФД из других наборов, это может привести к неправильным результатам, поскольку все компоненты набора подобраны для системы ТМБ-ЦФР.

В тест-системах с ОФД и ТМБ обычно используются стоп-реагенты, отличающиеся количеством серной кислоты, поэтому нельзя использовать стоп - реагент из тест-системы с комплектацией ОФД для работы с тест-системой, укомплектованной ТМБ. Следует учитывать, что система ТМБ-ЦФР обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем система ОФД-ЦФР, поэтому необходима более тщательная и аккуратная работа во избежание попадания в лунки капель растворов, содержащих входящую в состав конъюгатов пероксидазу, с рабочих поверхностей оборудования, перчаток и спецодежды. Признаком такого нарушения правил работы является спорадическое появление на планшете лунок с более высокой оптической плотностью.

Учет результатов:

Следует учитывать, что реакция окисления ОФД при добавлении серной кислоты до конца не останавливается. Поэтому нежелательно измерять оптическую плотность лунок позже, чем через 30 минут после добавления серной кислоты в качестве стоп - реагента. Если в инструкции по применению не введено понятие «серой зоны», то желательно учитывать возможное влияние ошибок дозирования пипеткой (5%) и измерения оптической плотности спектрофотометром (10%). Таким образом, сыворотки, оптическая плотность которых после постановки ИФА отличается не более, чем на 15% от ОПкрит, следует признавать сомнительными.