Тема: Возбудитель кампилобактериоза

Цель занятия: Усвоить характерные особенности возбудителя кампилобактериоза и методы бактериологической и серологической диагностики данного заболевания

Задание:

1. Окрасить мазок по методу Романовского-Гимза;

2. Окрасить мазок по Граму;

3. Просмотреть мазок под микроскопом и картину зарисовать в тетради.

Материалы и оборудование: Культуры кампилобактера (вибриона) в полужидкой среде, в среде Китта — Тароцци и на плотной среде; фиксированные (неокрашен­ные) препараты (мазки), содержащие кампилобактерии; таблицы и биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 2, спириллы (изогнутые аэробы);

Порядок – Pseudomonodales;

Семейство – Spirillaceae;

Род – Spirillum (или Campylobacter);

Виды – C.foetus, C.jejuni, С. sputorum, С. fecalis,

Кампилобактериоз (вибриоз) — хроническое заболевание крупного рогато­го скота и овец, характеризуется главным образом абортами, бесплодием, гибе­лью молодняка, задержанием последа, метритом, вагинитом. У овец массовые аборты проявляются обычно во второй половине суягности.

Возбудитель кампилобактериоза — Campylobacter fetus (foetes), относя­щийся к роду Campylobacter, семейству Spirillaceae.

С. fetus подраз­деляется на три подвида: С. fetus subsp. fetus (патогенный для крупного рогатого скота, морских свинок и куриных эмбрионов), С. fetus s. intestinalis (вызывает аборты у овец, спорадически у коров), С. fetus s. jejunum (вызывает аборты у овец, содержится в кишечнике здорового крупного рогатого скота, свиней, птиц).

Патологический материалом служат абортированный плод, плацента, слизь с шейки матки, взятая стерильно в первые 3—4 дня после аборта или в пе­риод охоты. От быков-производителей направляют препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от животных, убитых с диагностической це­лью,— матку, влагалище, лимфоузлы тазовой полости (доставлять свежими или охлажденными на льду).

Микроскопия. Готовят мазки, окрашивают по Граму или фуксином Циля, раз­веденным дистиллированной водой 1 : 5 (1—2 минут). Кампилобактерии окраши­ваются грамотрицательно, полиморфные — встречаются в виде удлиненных спи­рилл, мелких кокков, «летящих чаек», в молодых культурах часто имеют вид запя­той, встречаются и S-образные формы. Длина 1,5—7 мкм, диаметр 0,2— 0,5 мкм. Подвижность осуществляется за счет одного полярного жгутика (иногда по одному жгутику на обоих концах). Движение прямолинейное. При окраске по методу Романовского — Гимза в цитоплазме клетки обнаруживают зернистость (особенно в концевых участках). Спор и капсул не образуют. Препараты (мазки из патматериала и культур) можно исследовать посредством метода РИФ (иммуннофлуоресценции).

Культивирование и культуральные свойства. Кампилобактеры — микроаэрофилы. Учитывая это, его культивируют в присутствии 10 % СО₂ при температу­ре +37—38 °С. Для первичного получения культуры высев из патологического материала осуществляют в полужидкие и на плотные питательные среды с до­бавлением крови или кровяной сыворотки. В полужидком печеночном агаре (0,2 %-ный) появляется рост культуры кампилобактера через 2—7 суток вблизи по­верхности среды в пробирке в виде серовато-белого, серовато-голубоватого дис­ка; без пересева культура выживает не более 10—12 дней. Для более длительного сохранения кампилобактер культивируют в среде Китта — Тароцци и сохраняют холоде (4 °С). На 2 %-ном мясо-пептонном печеночном агаре проявляется сла­бый рост с 3—4-го дня в виде мелких колоний или сплошного налета. В кровя­ном или сывороточном бульоне рост скудный в виде нежного облака. Каждую пробу высевают на несколько чашек Петри, растирая шпателем по поверхности агара. Рост характеризуется появлением мелких росинчатых голубоватых колоний, которые затем пересевают на полужидкий кровяной, сывороточный агар или среду Китта-Тароцци (для получения чистой культуры). Не растет в МПБ с добавлением 3,5 % NaCl.

Биохимические свойства выражены слабо. Бактерии продуцируют каталазу, штаммы, выделенные от овец, слабо образуют сероводород, не ферментируют углеводы.

Биопроба. Заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно, или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течении 12 дней аборта не наступит, морских свинок убивают и исследуют плоды и содержимое полости матки. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и овцах — заражают подкожно или орально. Животные не погибают, они абортируют или их убивают (при отсутствии аборта).

Серологическая диагностика. Антигенное строение кампилобактера изучено недостаточно. Установлен тот факт, что антигенное строение штаммов, выделенных от крупного рогатого скота и овец, отличаются друг от друга. Различают четыре ти­па, но бычьи относят еще к пятому серологическому типу; так, Camp. fetus subsp. fetus обозначают как серовар 1, С. fetus subsp. intestinalis — серовар 2. Антигенное строение имеет значение для серологической диагностики и в биологической про­мышленности для получения (производства) диагностических сывороток. С диагностической целью применяют три серологических метода — РА, РСК (РДСК) и метод флуоресцирующих антител (МФА).

Для РА в лабораторию направляют пробы влагалищной слизи от телок, ис­пользованных для биопробы, от коров с расстройством полового цикла. Слизь берут марлевым тампоном в период полового покоя животного, готовят вытяжку, фильтруют, разводят 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400. Предварительно для получе­ния вытяжки (экстракта) слизи с тампона последний помещают в пробирку с 5 мл стерильного формалинизированного 3 %-ного раствора NaCl, выдерживают 12 — 14 часов при +1- 4 °С, тампон отжимают пинцетом, жидкость центрифугируют 30 минут при 2,5- 3 тыс. об/мин. РА ставят в пробирках с влагалищной слизью в четырех разведениях. В пробирки первую и вторую наливают по 0,5 мл исходного экстракта слизи, во вторую, третью и четвертую — предварительно наливают по 0,5 мл формали­низированного 3 %-ного NaCl. Из второй пробирки переносят в третью 0,5 мл, из третьей — в четвертую. Из последней 0,5 мл удаляют в сосуд с дез. раствором. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл (1 млрд) взвеси антигена. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при +37 °С на 24 часа, дополнительно вы­держивают 3—6 часа при комнатной температуре, затем учитывают результат.

Наряду с исследуемыми пробами материала обязательно ставят контроли: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации): в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добавляют 0,5 мл 3 %-ного раствора NaCl; 2) контроль активности антигена: в каждую пробирку с разведенной агглютини­рующей сывороткой первого типа (1 : 50—1 : 400) добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специфичности антигена: в две пробирки по 0,5 мл нормальной сы воротки в разведениях 1 : 100 и 1 : 200 добавляют по 0,5 мл антигена. Все про­бирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Учет результатов начинают с контролем антигенов. Отрицательная реакция в первом и третьем контролях (при положительной во втором) свидетельствует о правильности постановки реакции и специфичности антигена (кампилобактерийный антиген представляет собой 10 млрд/мл взвесь кампилобактерий, убитых формалином). Перед употреблением его встряхивают, разводят 3 %-ным раство­ром NaCl, содержащим 0,3 % формалина 1:10.

У больных овец (абортировавших) для исследования берут сыворотку кро­ви (свежую или консервированную борной кислотой). Помимо РА, сыворотку животных исследуют также методами РДСК или иммунофлуоресценции.

Контрольные вопросы:

1. Патологический материал, направляемый в лабораторию, и его бактериологи­ческое

исследование.

2. Латинское название возбудителя кампилобактериоза (вибриоза), его морфоло­гические и

культуральные особенности.

3. Питательные среды, применяемые для культивирования С. fetus.

4. Методы серологической диагностики кампилобактериоза.