Метод окраски капсул по Дюгиду

1. На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помеща­ют таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.

2. Сложенной много раз промокательной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жид­кости между ними. Препарат смотрят под большим уве­личением, применяя безыммерсионные и иммерсионные объективы.

Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-чер­ном фоне.

Метод окраски капсул по Гиссу

1. Взятую петлей бактериальную суспензию смеши­вают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.

2. Высушивают мазок на воздухе и мягко фиксиру­ют его нагреванием.

3. Покрывают мазок красящим реактивом кристал­лического фиолетового (кристалический фиолетовый 0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.

4. Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO₄ ´ 5H₂O). Подсушивают впитывающим воду мате­риалом и смотрят в микроскоп.

Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микро­организмы — темно-фиолетовыми.

Метод окраски капсул по Антони

1. Высушенный на воздухе мазок окрашивают в те­чение 2 мин 1% (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.

2. Краситель отмывают 20% (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO₄ ´ 5H₂O), удаляют избы­ток последнего и подсушивают впитывающим влагу ма­териалом.

Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганиз­мы — темно-фиолетовыми.

Способ Михина

Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькои в течение 2—3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.

Микроскопичиская картина: капсулы—светло розовые, бакте­рии—темно-синие.

Способ Гисса

Тонкий мазок, зафиксированный на пламени, окрашивают раствором основного фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора краски + 19 частей дистиллированной воды) с нагреванием до отхождения паров, затем оставляют в покое на 30 секунд. После этого краску смывают большим количеством 20% водного раствора медного купороса и обсушивают без промывания водой между листами фильтровальной бумаги.

Микроскопическая картина: капсулы—голубого цвета, тела микробов—темно-красного, эритроциты—розового, плазма лейкоцитов— голубого, ядра лейкоцитов—темно-красного.

Способ Ольта

Мазок окрашивают 2—3% водным раствором сафранина в течение 1—3 минут с последующим быстрым смыванием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают по­кровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости. Благо­даря прохождению световых лучей через слой воды усиливается разница в лучепреломлении капсулы и тела бактерии; под микроскопом отчетливо видны окрашенные капсулы.

Микроскопическая картина: капсулы—бледно-желтого, а бактерии—коричневого цвета.

Модификация способа Ольта

После окраски сафранином (по оригиналь­ной прописи) мазок докрашивают 1% водным раствором метиленовой синьки в течение 2 минут. Быстро смыть водой, обсушить.

Микроскопическая картина: палочки—синие, капсулы— розовые.

Способ Ребигера

Этот простой и демонстративный способ окраски со­стоит в том, что препарат фиксируют не на пламени, а формалином, причем фиксация происходит одновременно с окраской. Для этой цели готовят сле­дующий раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл продажного (40%) формалина; дают раствору постоять несколько часов, затем этот насыщенный при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированный мазок указанным выше раствором в течение 15—20 секунд, быстро промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы—красновато-фио­летовые, бактерии—темно-фиолетовые.

С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) на 15—20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок обсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: капсулы—бледно-розового цвета, бактерии—синие.

Способ Гусельниковой (1949)

Для выявления капсульных микробов в культурах предлагает следующий способ: каплю 3—4% водного раствора конгорот нанести на абсолютно обезжиренное предметное стекло, добавить к ней одну каплю исследуемой культуры, тщательно размешать и оставить на 5—7 минут; затем каплю размазать по стеклу, как при изготовлении мазка крови, высу­шить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.

Микроскопическая картина: фон—красно-розовый, капсулы—бесцветные, микроорганизмы—розовые.

Способ Кауфмана

Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут. Краску смывают водой и мазок погружают в 0,5% раствор азотнокислого серебра или в 0,25% водный раствор протаргола на 3—4 минуты, затем окрашивают карболовым раствором фуксина, разведенным 1 : 20, в течение 5—10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы—темно-красные, бактерии—темно-синие.

Способ Ионе

Фиксированный мазок окрашивают 2% водным раствором метилвиолета (или генцианвиолета) в течение 1—2 минут при подогревании. Краску быстро смывают небольшим количеством воды, мазок обрабатывают 2% водным раствором уксусной кислоты в течение 10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы—розовато-фиоле­товые, бактерии—темно-фиолетовые.

Окраска спор

При исследовании живых неокрашенных препаратов, изготовленных из старых, главным образом агаровых, культур, споры чаще всего обнаружи­ваются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. В микробной клетке споры располагаются или в центре ее (экваториально), или на конце (терминально), или ближе к концу палочки (субтерминально). Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окраши­вают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, после­дующим обесцвечиванием и дополнительной окраской.

Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамле­ние и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии—это эндоспора, особенно если отсут­ствует информация о теплоустойчивости. Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благо­даря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1% KМnO₄ в 0,3Н НNО₃ или 0,3Н НСl). При этом оболочка споры теряет целост­ность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашивае­мая основными красителями, выпячивается наружу че­рез образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скоротечности происходящего события (менее 20 мин пребы­вания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 мин в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них—негативного окрашивания—по­лучают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взя­тый петлей 7% (вес/объем) водный нигрозин сме­шивают на покровном стекле с набранной петлей куль­турой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и вы­сушивают на воздухе. Покровное стекло переворачива­ют пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндо­споры выглядят, как сильно преломляющие свет сфери­ческие или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.

Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашива­нию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию. Полезным методом пози­тивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.