Простые и сложные способы окраски микроорганизмов. Способы окраски спор, жгутиков, капсул, включений.

Для окрашивания препаратов пользуются кислыми, щелочными и ней­тральными анилиновыми красителями. Наиболее широкое применение нашли основной и кислый фуксин, метиленовый синий, генцианвиолет и везувин.

Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводя его дистиллированной водой в соотношении 1:10. Состав РАСТВОРА ФУКСИНА ЦИЛЯ: основной фуксин – 1 г; спирт этиловый 96 % – 10 мл; фенол кристаллический – 5 г; глицерин – несколько капель; вода дистиллированная – 100 мл.

Метиленовый синий Леффлера готовят, прибавляя к 30 мл насыщен­ного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 % этилового спирта) 1 мл 1% NaOH или KOH и 100 мл дистиллированной воды.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру (3–5 мин) гранулы волютина у дифтерийных коринебактерий приобретают темно–синий, а палоч­ка – голубой цвет.

При сложных методах окраски мазков применяют два–три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Граму, Цилю–Нельсену, Нейссеру, Бурри–Гинсу, Романов­скому–Гимзе и некоторые другие.

При окраске по НЕЙССЕРУгранулы ВОЛЮТИНА у дифтерийных коринебактерий окрашиваются в сине–черный, а бактерия – в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий – 0,1 г, спирт – 2 мл, ледяная уксусная кислота – 5 мл, дистиллированная вода – 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20– 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 –3 мин окрашивают везувином (про­кипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды).

Количественное содержание ПЕПТИДОГЛИКАНА, содержащегося в # стенке, определяет характер ок­раски бактерий и других прокариот по ГРАМУ. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине–фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5–20 % пептидо­гликана, – в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных. Техника окраски по Граму: 1. Фиксированный мазок 1–2 мин ок­рашивают раствором генцианвиолета (генцианвиолет – 1 г, этанол 96 % – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл; по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, ко­торую смачивают 2–3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1–2 мин фуксином Пфейф­фера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают.

Для выявления грамположительных КИСЛОТО– И СПИРТОУСТОЙЧИВЫХ микобактерий туберкулеза и лепры, которые из–за большого количества в клеточных оболочках жировосковых веществ, миколовой кислоты и дру­гих оксикислот непроницаемы для разведенных растворов красителей, используют окраску по методу ЦИЛЯ – НИЛЬСЕНА. Окрашивание их по этому способу достигается при помощи концентрированного фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки микобактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минераль­ных кислот и этилового спирта. Техника окраски. 1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой. 2. Препарат об­рабатывают (обесцвечивают) 5 % раствором серной кислоты и промывают водой. 3. На мазок наливают водно–спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3–5 мин промывают водой и высушивают. Кислотоус­тойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кис­лотой, – в светло–синий.

При необходимости дифференциации возбудителей лепры от мико­бактерии туберкулеза используют окраску мазков по методу Семенови­ча–Марциновского – микобактерии леп­ры окрашиваются в красный цвет, а микобактерии туберкулеза остаются неокрашенными.

Для обнаружения КАПСУЛ бактерий, плохо воспринимающих красите­ли, используют метод БУРРИ–ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (на­носят 2–3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3–5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

О наличии ЖГУТИКОВ чаще всего судят по направленному характеру движения бакте­рий в раздавленной и висячей каплях. Но можно использовать и некоторые методы окраски, например по МОРОЗОВУ: 1) обработка препарата кислотой, при этом оболочки и жгутики разрыхляются; 2) закрепление разрыхленных структур танином; 3) обработка азотнокислым серебром, оно окутывает каждый жгутик и саму # толстым слоем, давая различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого.

СПОРЫ. Эндоспоры бактерий выдерживают дли­тельное кипячение, действие горячего возду­ха (140–150°С) и химических дезинфици­рующих веществ, многие годы сохраняются в почве, на растительности и предметах. По­падая в организм человека и животных, спо­ры патогенных бактерий прорастают в мате­ринские клетки за несколько часов.

Водным фуксином, водно–спиртовым метиленовым синим и по Граму эндоспоры не окрашиваются, так как их плотная много­слойная оболочка непроницаема для обыч­ных красителей. В мазках из патологических материалов, культур бацилл и клостридии, окрашенных простыми красителями, споры выглядят в виде бесцветных телец внутри окрашенных в соответствующий цвет вегетативных клеток или вне их. Окрашивать их можно по методу Циля–Нельсена, используя для обес­цвечивания мазков после обработки их фуксином Циля не 5%, а 1% серную кислоту. При этом эндоспоры, так же как микобактерии тубер­кулеза, красятся в розовый цвет и будут хорошо видны на синем фоне бактерий. Для окрашивания спор можно использовать метод по ОЖЕШКО: 1) протравка оболочки споры горячей кислотой; 2) окраска по Цилю–Нильсену.

При исследовании морфологии паразитов крови (спирохеты – бледная трепонема, простейшие – малярийный плазмодий), а т/же ФЭ, используют окраску по РОМАНОВСКОМУ–ГИМЗА. Краска состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Окрашивает ЦИТОПЛАЦМУ в голубой, а ЯДРА в красно–фиолетовый цвет. Этот метод позволяет обнаружить различные цитологические детали.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне и наносят на него флюорохром на 20–30 мин. Сделанный препарат промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.