Груповий аналіз мікрофлори грунту

Матеріали та обладнашя: 1) мікроскопи, 2) предметні і накривні стекла, 3) бактеріологічні петлі, 4) чашки Петрї. 5) пробірки з поживним середовищем (МПА), 6) спиртівки, 7) перильні піпетки, 8) ерленмеєрівські колби на 0,5л, 9) мірні колби на 100 мл, 10) грунт, 11) аптечні терези; 12) сусло-агар, 13) крох-мало-аміачний агар, 14) картопляний агар.

Основні відомості. При вивченні біодинаміки грунтів велике-значення має встановлення якісного ї кількісного складу

Для проведення лабораторних робіт доцільно першу партію пластинок оброс­тання закладати за два тижні до початку занять.

мікроорганізмів, що належать до різних фізіологічних груп, оскільки
процес перетворення речовин в грунті тісно пов'язаний з життєді­яльністю різноманітних мікробів: бактерій, грибів, актиноміцетів
тощо. Диференційоване виділення з грунту різних фізіологічних,
груп мікроорганізмів та аналіз їх можливі при використанні різних
поживних середовищ.

Для цього використовують елективні і диференціально-діагно­стичні поживні середовища. Залежно від фізіологічної групи мік­робів і методу досліджень застосовують різні середовища (МПА, МПА+сусло-агар, крохмале-аміачний агар, середовища Виноградського, Гільтая, Ешбі тощо). За допомогою цього методу одержу­ють значно більшу кількість бактерій та інших мікробів, ніж мето­дом пластинок обростання, тому що на спеціальних середовищах виявляються ті мікроорганізми, які не ростуть на м'ясо-пептонному агарі.

Для виявлення мікробів різних фізіологічних груп таїх кількіс­ного аналізу користуються методом розведень. Студентам можна рекомендувати виявити і вивчити такі фізіологічні групи мікробів: спороносні і неспороносні (пігментоутворюючі) форми бактерій на МПА; окремо — групу бацил (Вас.subtilis , Вас. теsепtеrісиs, Вас. теgatеrіит, Вас. сеrеиs та ін.) на МПА+сусло-агар, міксобак­терії (з родів Sоrотgium, Мухососсиs тощо) на. картопляному ага­рі; мікобактерії і актиноміцети на крохмале-аміачному агарі і гри­би на сусло-агаровому середовищі або на середовищі Чапека.

Проведення роботи. З відібраної групової проби беруть сте­рильним шпателем 10 г грунту, вміщують його в конічну колбу на 250—-300 мл, доливають туди 90 мл стерильної води і збовтують на спеціальному апараті протягом 10 хв. Щоб осіли грубі частинки, суспензію відстоюють, а потім виготовляють з неї серію розведень і висівають на різні поживні середовища.

Одночасно беруть з середньої проби 10ггрунту для визначення
вологості, оскільки результати дослідів перераховуються на абсолютно сухий грунт.

Посів на м'ясо-пептонний агар (МПА) 1 мл ґрунтово: суспензії потрібного розведення (частіше беруть розведення 1 : 100 000) вносять у стерильну чашку Петрі, сюди ж. виливають розплавлений і охолоджений до 40—45°СМПА і старанно перемі­шують. Коли ставиться завдання систематизувати мікрофлору за типом колоній, то краще посів робити нащоверхні агарових плас­тинок (беруть 0,05 мл або 1 краплину посівного матеріалу). Для виявлення бацилярних форм мікробів Е. М. Мішустін рекомендує використовувати змішане середовище з МПА і сусло-агару (у від ношенні. 1:1). Перед посівом на. МПА 4-сусло-агар грунтов;. суспензію прогрівають при температурі 70^еС протягом 15 хв дл.^: звільнення її від вегетативних форм мікробів.

Засіяні чашки Петрі позначають і вміщують у термостат пр: температурі 25—30° С на 3—5 діб. Облік кількості колоній проводять па 3—4 день. Після підрахунку колоній їх згруповують з; культуральними ознаками для якісної оцінки сапрофітних мікробів

жовтуватого забарвлення. Вас. теgаtеrіит має гладенькі білого або кремового кольору опуклі колонії з концентричними колами.
Вас. сеrеиs утворює плескаті матові з хвилястими краями колонії.

Мікобактерії а крохмале-аміачному агарі ідентифікуються на 7—10 день по дрібних куполоподібних колоніях жовтого кольору. Актиноміцети на цьому середовищі утворюють сірий, зеленувато-сірий і рожевий повітряний міцелій. Міксобактерії з роду Роlуапginum £Іпит на картопляному агарі утворюють плодові,тіла переважно червоно-коричневого кольору, а з роду Мухососсиs — безбарвні або слабкорожеві плодові тіла.

Підрахунок кількості грибів на сусло-агаровому середовищі проводять після двох діб інкубації, а визначення родового складу — на 7—8 день. Мукор цвільовий (Мисоr тисеdo) утворює густі коло­нії з міцелію жовтувато-білого або сріблясто-сірого кольору, ризоп — темно-сірого кольору. Аsреrgіllus ідентифікується на сусло-агарі переважно колоніями темного і жовтого кольору, а Репісіl-Ііит — зеленого.

Лабораторна робота №6

Тема:Фарбування бактерій (за Грамом)

Матеріали та обладнання: 1) мікроскопи, 2) предметні стекла, 3) бактеріо­логічні петлі, 4) спиртівки, 5) досліджувані культури, 6) фільтрувальний папір, 7) карболовий генціанвіолет, 8) розчин Люголя, 9) фуксин, 10) спирт, 11) кедрова олія, 12) промивалки з дистильованою водою.

Основні відомості. Фарбування за Грамом — один з найпоши­реніших у лабораторній практиці складних методів фарбування мікроорганізмів. Суть його полягає в тому, що клітини деяких видів мікробів утворюють нерозчинні у спирті сполуки йоду з основною фарбою, наприклад, з генціанвіолетом. В інших видів мікроорганізмів такі сполуки хоч тимчасово і утворюються, але після обробки спиртом швидко розчиняються. Метод фарбування за Грамом є універсальним і застосовується переважно з діагно­стичною метою.

За цим діагностичним методом забарвлювання всі мікроби по­діляються на дві групи: на грампозитивні, які забарвлю­ються у синьо-фіолетовий колір, і грам негативи і, які при тій же техніці фарбування забарвлюються в рожевий колір після дофарбування фуксином. Результати фарбування за Грамом залежить від техніки виготовлення мазка(він повинен бутитонким), тривалості фарбування, а також від віку досліджуваної культури (відомо, що в старих культурах часто грампозитивні клітини фарбуються як грамнегативні).

Для фарбування за Грамом доцільно на одному предметному

склі поряд з мазком з досліджуваної культури робити мазок із відомих грампозитизних або грамнегативних мікробів, які будуть контрольними. Треба зазначити, що до грампозитивних мікроорганізмів належать майже всі види кулястих бактерій, спороносні бацили (Вас. subtilis, Вас. тesentericus, Вас. тусоidеs тощо), дріжджі, молочнокислі стрептококи і паличковидні бактерії. До грамнегативних бактерій належать Ваtі. соlі, Рrоtеиs vulgaris, Pseudomonas Fluorescens , Serratia marcescens, Васt. Сyanogenes тощо. Проведення роботи. На висушений і зафіксований мазок кла­дуть клаптик фільтрувального паперу і наносять на нього кілька-, крапель розчину карболового генціанвіолету. Витримують фарбу протягом1—2 хв. Потім знімають папірець і на препарат нали вають невелику кількість розчину Люголя. Розчин не зливають доти, поки мазок не почорніє. (1—2 хв). Далі зливають розчин Люголя і мазок обробляють спиртом протягом 0,5—1 хв. Після цього препарат старанно промивають дистильованою водою, до­фарбовують фуксином Пфейффера (1—2 хв) і знову промивають водою і висушують на повітрі. Виготовлений таким способом пре­парат вивчають за допомогою імерсійної системи. Фарбування бактерій за Грамом можна проводити і в модифікації А. Синєва. Для цього на зафіксований мазок кладуть клаптик фільтрувального паперу, заздалегідь змочений розчином генціан­віолету і добре висушеного. Зверху на папір наносять 2—3 краплі води і залишають на 2 хв. Далі техніка фарбування така, як за Грамем.

Лабораторна робота №7