Определения нитритов и нитратов

Метод применяют при анализе всех видов продукции. Метод определения нитритов основан на экстрагировании нитритов водой, очистке экстракта и фотометрическом измерении интенсивности окраски, образующейся при взаимодействии нитрит-иона ( ) с ароматическими аминами. Нижний предел обнаружения нитрит-иона в колориметрируемом растворе - 0,02 мкг/см³, нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - 0,5 мг/кг.

Метод определения нитратов основан на экстрагировании их водой, очистке экстракта, количественном восстановлении нитратов в Ж нитриты на кадмиевой колонке с последующим фотометрическим измерением интенсивности окраски азосоединения, образующегося при взаимодействии нитритов с ароматическими аминами. Нижний предел обнаружения нитрат-иона в колориметрируемом растворе - 0,03 мг/см³, нижний предел надежного определения в анализируемой пробе - 1,5 мг/кг.

На выбор исследователя предлагаются два равноценных варианта -определения нитритов и нитратов.

Вариант I содержит следующие этапы работы: отбор и подготовка проб, приготовление растворов для испытаний, подготовка кадмиевой колонки к работе, построение градуировочного графика для определения нитратов, проведение испытаний проб на содержание нитритов и нитратов, обработка результатов анализа.

Вариант II в основном аналогичен первому и отличается тем, что стадия "построение гредуировочного графика для определения нитратов заменяется стадией "проверка восстановительной способности колонки", три этом расчет содержания нитратов проводится на основе градуировочного графика по нитритам.

Вариант I

Определение нитратов

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; ареометры; баня водяная с терморегулятором; спектрофотометр или фотоэлектро-колориметр различных марок; колбы конические вместимостью 50, 100, 200, 250, 300 см³; колбы мерные вместимостью 50, 100, 200, 500, 1000 см³; цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100, 250 см³; стаканы химические вместимостью 50, 500, 1000 см³; пипетки (бюретки, дозаторные вместимостью 1, 5, 10, 20 см³; воронки стеклянные; палочки стеклянные, фильтры, обеззоленные (перед употреблением фильтры необходимо промыть не менее 5 раз дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу в течение 0,5 часа при 70-80º С); бумага универсальная индикаторная; цинк металлический гранулированный (или в палочках 150×8); сульфат кадмия; сульфат цинка 7-водный; гексацианоферрат (II) калия 3-водный; нитрат калия; кислота и соляная, плотностью 1,19 г/см; аммиак водный, плотностью 0,9 г/см³; сульфаниламид; сульфаниловая кислота; N-(I-нафтил)этилендиамин дигидрохлорид; I-наaтиламин; кислота уксусная; вода дистиллированная, нитрат натрия, тетраборат натрия; гидроксид натрия.

Подготовка к испытанию. Приготовление растворов для осаждения белков. Раствор сульфата цинка: 535 г сульфата цинка, взвешенного с точностью до 0,1 г, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки.

Раствор гексацианоферрата (II) калия 172 г, взвешенного с точностью до 0,1 г, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки. Насыщенный раствор тетрабората натрия: 50 г тетрабората натрия, взвешенного с точностью до 0,1 г, растворяют дистиллированной водой с температурой 50±2°С в мерной колбе вместимостью 1000 см³, затем охлаждают до температуры 20±2°С и доводят объем до метки. Раствор гидроксида натрия концентрацией 1 моль/дм³. Аммиачный буфер: 50 см³ соляной кислоты плотностью 1,19 г/см³ растворяют в 600 см³ дистиллированной воды, добавляют 135 см³ концентрированного водного аммиака плотностью 0,9 г/см³, перемешивают. Проверяют рН раствора и при необходимости доводят рН до 9,6-9,7, доводят дистиллированной водой до метки. Раствор соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/дм³ (0,1 н) : 7,8 см³ соляной кислоты плотностью 1,19 г/см³ растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки.

Приготовление растворов для проведения цветной реакции:

1) раствор сульфаниламида: 1,0 г сульфаниламида, взвешенного с точностью до 0,1 г, помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 200 см³ дистиллированной воды и 10 см³ концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают на кипящей водяной бане до полного растворения сульфаниламида, затем раствор охлаждают и доводят до метки дистиллированной водой, если необходимо, фильтруют;

2) раствор N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (НЭДА): 0,1 г

НЭДА, взвешенного с точностью до 0,1 г, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 50 см³ и доводят объем раствора до метки. Растворы сульфаниламида и НЭДА хранят в холодильнике в склянке из темного стекла с притертой пробкой не более 2 недель; 3) раствор сульфаниловой кислоты: 1,5 г сульфаниловой кислоты, взвешенной с точностью до 0,1 г растворяют в 200 см³ горячей дистиллированной воды и после охлаждения добавляют 50 см³ ледяной уксусной кислоты; 4) раствор 1-нафтиламина: 1,2 г 1-нафтиламина, взвешенного с точностью до 0,1 г растворяют в 50 см³ ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до 200 см³. Растворы сульфаниловой кислоты и 1-нафтиламнна хранят в холодильнике в склянке из темного стекла с притертой пробкой не более 2 недель; 5) раствор соляной кислоты: 445 см³ соляной кислоты (плотность 1,19 г/см³) растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 дм³ и доводят объем раствора до метки.

Приготовление основного стандартного раствора нитратов: Ч 1,630 г нитрата калия, перекристаллизованного из воды и высушенного до постоянной массы при температуре 110-120°С, взвешивают с точностью до 0,001 г, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и доводят объем раствора до метки. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике до 6 месяцев.

Рабочий раствор нитратов: 10 см³ с точностью до 1 см³ основного стандартного раствора нитратов помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм³ и доводят дистиллированной водой до метки. 1 см³ раствора содержит 10 мкг . Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике не более 1 месяца.

Подготовка кадмиевой колонки. Приготовление пористого кадмия. В химической стакане вместимостью 1 дм³ растворяют 20 г сернокислого кадмия в 500 см³ дистиллированной воды и помещают 1-2 палочки металлического цинка (возможно использование гранулированного цинка). По мере образования кадмия его удаляют при помощи шпателя в другой стакан с дистиллированной водой. Собранный кадмий декантапией промывают несколько раз дистиллированной водой, используя не менее 2 дм³: суспензию кадмия переносят в гомогенизатор и измельчают до получения частиц диаметром 0,3-0,8 мм. Содержимое гомогенизатора переносят в химический стакан, жидкость декантируют и кадмий многократно промывают (5-6 раз), используя по 100-200 см³ 0,1 моль/дм³ (0,1 н) раствора соляной кислоты. При этом декантопией отделяют мелкую фракцию кадмия. Хранят кадмий под слоем 0,1 моль/дм³ (0,1н) раствора соляной, кислоты. В день анализа кадмий с целью удаления пузырьков газа перемешивают. Жидкость декантируют и кадмий промывают несколько раз дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге.

При подготовке кадмиевой колонки к работе собирают систему согласно рис. 2. Сначала ее полностью заполняют водой и при открытом кране вносят суспензию пористого кадмия до тех пор, пока высота слоя кадмия не достигнет 130-150 мм. Поверхность кадмия в колонке должна всегда быть покрыта жидкостью.

Перед началом роботы и после каждого анализа кадмиевую колонку промывают последовательно 25 см³ 0,1 моль/дм³ (0,1 н) раствора соляной кислоты, 50 см³ дистиллированной воды и 25 см³ разбавленного (1:9) аммиачного буфера.

Построение градуировочного графика для определения нитратов: в стаканы или колбы на 50 см³ вносят пипеткой 1,0;2,0; 4,0; 8,0 и 10,0 см³ рабочего раствора (с. 124), добавляют дистиллированную воду до объема 20 см³, 5 см³ аммиачного буфера и перемешивают. Для приготовления контрольного раствора в стакан или колбу на 50 см³ вносят пипеткой 20 см³ дистиллированной воды и 5 см³ аммиачного буфера.

Через предварительно промытую кадмиевую колонку пропускают со скоростью 5 см³/мин сначала один из полученных растворов нитратов, затем 25 см³ дистиллированной воды, собирая элюат в мерную колбу вместимостью 50 см³, и доводят объем до метки.

25 см³ полученного элюата помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³ и проводят цветную реакцию, для чего в каждую колбу добавляют по 5см³ раствора сульфаниламида (п.1) и по 1 см³ раствора соляной кислоты (п. 5), перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем добавляют по 1 см³ раствора НЭДА (п.2), доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают и через 10 мин колориметрируют в кюветах толщиной 10 мм при длине волны 538 нм по отношению к контрольному раствору.

В случае использования сульфаниловой кислоты и 1-нафтнламина в колбы добавляют по 1 см³ раствора сульфаниловой кислоты (п.3), 3 см³ раствора соляной кислоты (п.5), перемешивают и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляют по 1 см³ раствора 1-нафтиламина (п.4), перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки и колориметрируют через 2 часа.

По полученным данным строят градупровочный график, откладывая по оси ординат значение оптической плотности, а по оси абсцисс значения концентрации нитрат-иона: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/см³ колориметрируемого раствора.

Проведение испытания. Пробы продукции тщательно измельчают с помощью терки, мясорубки пли гомогенизатора. Из подготовленною пробы отбирают навеску в количестве 20 г (при низких до 50 мг/кг содержаниях нитратов) или 10 г (в остальных случаях) с точностью до 0,1 г. Навеску продукта переносят в 200-300 см³ коническую колбу, добавляют 100 см³ теплой дистиллированной воды (60-65°С) и тщательно перемешивают. Колбу помещают на водяную баню (60-65º С) для осаждения белков вносят 5 см³ насыщенного раствора натрия тетрабората , 5 см³ раствора сульфата цинка и 5 см³ раствора гексацианоферрата(II) калия, перемешивая содержимое после ёдобавления каждого реактива. Выдерживают при этой температуре 15 мин, затем охлаждают до комнатной температуры. Содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу на 200 см³, ополаскивают два раза по 10-15 см³ теплой дистиллированной водой и объединяют с основной смесью; объем доводят водой до метки и фильтруют через бумажный фильтр (фильтрат 1). Фильтрат 1 служит для определения нитратов и нитритов.

При получении мутного фильтрата в качестве осадителей можно использовать 5 см³ раствора сульфата цинка и 10 см³ 1 молъ/дм³ (1н) раствора гидроксида натрия.

Перед началом анализа необходимо оценить наличие нитратов и нитритов во всех используемых реактивах (холостая проба), для чего проводят все операции без внесения продукта. Для этого в мерную колбу на 200 см³ вносят 100 см³ дистиллированной воды, по 5 см³ насыщенного раствора натрия тетрабората, раствора сульфата цинка и раствора гексацианоферрата(II) калия или 5 см³ раствора сульфата цинка и 10 см³ раствора гидроксида натрия концентрацией 1 моль/дм³ (1 н), перемешивают содержимое колбы после добавления каждого реактива, затем объем доводят водой до метки и фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате (холостал проба) определяют содержание нитратов и нитритов.

Если содержание нитратов к нитритов в "холостой пробе" превышает 0,03 мкг/дм³, то используемые в опыте реактивы следует подвергнуть дополнительной очистке (перегонке, перекристаллизации) или заменить.

Определение содержания нитратов в образце. В стакан или колбу вместимостью 50 см³ вносят от 1 до 40 см³ фильтрата 1 в зависимости от предполагаемого содержания нитратов в анализируемой продукции. При ожидаемой концентрации от 0 до 100 мг/кг объем фильтрата, используемого для восстановления на колонке, составляет 40 см³, 100-300 мг/кг – 20 см , 300-600 мг/кг – 1° см³, 600-1000 мг/кг – 5 см³, свыше 1000 мг/кг – 2 см³. К указанному раствору добавляют 5 см³ аммиачного буфера, перемешивают; пропускают через кадмиевую колонку со скоростью 5 см³/мин сначала полученный раствор образца, затем колонку промывают дистиллированной водой, собирая элюат в мерную колбу вместимостью 100 см³, и доводят объем до метки.

25 см³ полученного элюата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и проводят цветную реакцию (с. 126), увеличив объем реактивов для цветной реакции в 2 раза. Величину оптической плотности раствора определяют по отношению к контрольной пробе.

Для получения контрольной пробы в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят объем фильтрата (0,5-10 см³), равный тому объему, который используется для проведения цветной реакции при определении нитратов в образце. К этому фильтрату добавляют 1,0 см³ аммиачного буфера, 50 см³ дистиллированной воды и проводят цветную реакцию, как указано на с. 126.

Пример. Если для восстановления на колонке используется 10 см³ фильтрата I (V₂ = 10 см³), объем элюата, собираемого с колонки (V₃ = 100 см³), объем элюата, взятый на цветную реакцию (V₄ = 25 см³), а объем колориметрируемого раствора (V₅ = 100 см³), то объем фильтрата I, который следует использовать для получения контрольной пробы, составляет 2,5 см³.

Объем фильтрата I используемыq для восстановления на колонке	Объем фильтрата I, который следует брать для получения контрольной пробы
40 см3	10 см3
20 см3	5 см3
10 см3	2,5 см3
5 см3	1,25 см3
2 см3	0,5 см3

Обработка результатов анализа. Содержание нитратоа (X), выраженное в мг/кг продукта (в пересчете на нитрат-ион) вычисляют по формуле

Х = , (66)

где С - концентрация нитрат-иона в колориметрируемом растворе найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V₁ - общий объем экстракта, см³;

V₂ - объем фильтрата I, взятый на колонку, см³;

V₃ - общий объем элюата, см³;

m - масса навески продукта, г;

V₄ - объем элюата, взятый на цветную реакцию, см³;

V₅ - объем колориметрируемого раствора, см³.

Определение нитритов

Подготовка к испытанию. Приготовление основного стандартного раствора нитритов: 150 мг перекристаллизованного из воды и высушенного при температуре 110-120°С до постоянной массы нитрата натрия взвешивают с точностью до 0,001 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм³, растворяет в дистиллированной воде и доводят объем раствора до метки. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике не более одной недели.

Приготовление рабочего раствора нитритов: 10 см³ с точностью до 1 см³ основного стандартного раствора нитритов помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³ и доводят дистиллированной водой объем до метки. 1 см³ этого раствора содержит 2,0 мкг/ . Раствор готовят в день проведения анализа.

Построение градуировочного графика для определения нитритов: в мерные колбы вместимостью 50 см³ вносят 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 см³ рабочего раствора нитритов, доводят до 40см³ дистиллированной водой, в одну мерную колбу вносят 40 см³ дистиллированной воды (контрольный раствор), затем проводят цветную реакцию, для чего в каждую колбу добавляют по 5 см³ раствора сульфаниламида (п.1) и по 1 см³ раствора соляной кислоты (п.5), перемешивают и оставляют на 5 минут. Затем добавляют по 1 см³ раствора НЭДА (п.2), доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают и через 10 минут колориметрируют в кюветах толщиной 10 мм при длине волны 538 нм по отношению к контрольному раствору.

В случае использования сульфаниловой кислоты и 1-нафтиламина в колбы добавляют по 1 см³ раствора сулъфаниловой кислоты (п.3 ), 3 см³ раствора соляной кислоты (п.5), перемешивают и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. Затем добавляют по 1 см³ раствора 1-нафтиламина? (п. 4), перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки колориметрируют через 2 часа.

По полученным данным строят градуировочный график, откладывая по оси ординат значения оптической плотности; по оси абсцисс значения концентрации нитрит-ионов 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2 мкг/см³ коло-риметрируемого раствора.

Определение содержания нитритов в образце. В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 20 см³ фильтрата I и проводят цветную ре-акцию как на с. 126, измеряя оптическую плотность раствора относительно смеси, состоящей из 2 объемов фильтрата I и 3 объемов дистиллированной воды.

Обработка результатов испытания. Содержание нитритов (Х), выраженное в мг/кг продукта (в пересчете на нитрат-нон) вычисляют по формуле

X = , (67)

где С - концентрация нитрит-иона в колориметрируемом растворе, найденная по градуировочному графику мкг/см³;

V₁ - общий объем экстракта, см³;

V₂- объем фильтрата I, взятый на цветную реакцию, см³;

m - масса навески образца, взятая на анализ, г;

V₃ - объем колориметрируемого раствора, см³.

Вычисления проводят до целых чисел, мг/кг. За окончательный результат, выполненный в одной лаборатории, принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определении.

Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями, выполненными в одной лаборатории, зависит от уровня концентраций и при Р = 0,95 не должно превышать значений сходимости (r), указанных в табл. 29.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в разных лабораториях, зависит от уровня концентраций и при Р = 0,95 не доджно превышать значении воспроизводимости (R), указанных в табл. 29.

Таблица 29

Внутрилабораторная сходимость (r), межлабораторная воспроизводимость (R) и допустимое критическое отклонение от ПДК (С_rД) для фотометрического метода определения нитратов при различных уровнях

концентраций (X) г растениеводческой продукции[17]

	r	R	СrД при n = 2

Продолжение табл. 29

	r	R	СrД при n = 2
		33.2

При сравнении аналитических результатов с величиной ПДК (табл. 21) используется значение С_rД. Если разница обнаруженной концентрации и величина ПДК (или сертификата) не превышает значения С_rД, представленной в табл. 29, можно принять, что при доверительной вероятности Р = 0,95 определяемая концентрация сопоставима с ПДХ; если полученная разница превышает С_rД, обнаруженную концентрацию нитратов в продукте следует считать не соответствующей уровню ПДК.

Вариант II

Все разделы выполняются аналогично варианту I c некоторыми изменениями в части формулы расчете содержания нитратов. Вместо "построения градуировочного графика для нитратов" проводят "проверку восстановительной" способности колонки". Расчет ведут по формуле (68).

Проверка восстановительной способности кадмиевой колонки. В стакан или колбу вместимостью 50 см³ вносят пипеткой 20 см³ рабочего раствора нитрата ( с.124) концентрацией 10 мкг в см³ и 5 см³ аммиачного буфера и перемешивают.

Через предварительно регенерированную кадмиевую колонку пропускают со скоростью 5 см³/мин сначала 25 см³ приготовленного раствора нитрата калия, когда резервуар над колонкой опустеет, его промывают два раза, используя каждый раз по 15 см³ воды.

После того, как последняя порция воды стечет в колонку, полностью заполняют резервуар водой. Элюят собирают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки.

45 см³ полученного элюата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и проводят цветную реакцию (см. с.126). Величину оптической плотности растворов определяют по отношению к холостому раствору.

Если концентрация нитрита в элюате по градуировочному графику на нитриты (см. с.129) будет ниже 0,70 мкг нитрита в 1 см³ коло-риметрируемого раствора (т.е. 95% теоретического значения), то редукционную колонку нельзя использовать для анализа.

В этом случае кадмий необходимо перенести в химический стакан и залить на ночь раствором соляной кислоты, промыть водой и подготовить колонку (см.с.124).

Расчет содержания нитратов по варианту II. Если восстановительная способность кадмиевой колонки ≥ 95%, то количество нитратов в образце (X), выраженное в мг/кг продукте (в пересчете на нитрат-нон) может быть рассчитано по формуле

Х = , (68)

где 1,35 - коэффициент пересчета нитритов в нитраты;

С - концентрация нитритов, мкг/см³ колориметрируемого раствора, рассчитанная по градуировочному графику, полученному при калибровке стандартных растворов;

m - масса навески продукте, г;

V₁ - общий объем экстракта, см³;

V₂ - объем фильтрата, взятый на колонку, см³;

V₃ - общий объем элюата, см³;

V₄ - объем элюата, взятый на цветную реакцию, см³;

V₅ - общий объем колориметрируемого раствора, см³.

Регенерация кадмия. По окончании проведения анализа необходимо пробыть колонку с кадмием 25 см³ 0,1 моль/дг³ (0,1 н) раствором соляной кислоты, 50 см³ дистиллированной воды, 25 см³ разбавленного (1:9) аммиачного буфера (с.123) и вновь 50 см³ дистиллированной воды.

В случае появления пузырьков газа в колонке, снижения скорости элюации вследствие уплотнения кадмия или длительного перерыва в работе следует перенести кадмий из колонки в химический стакан и залить 100-200 см³ 0,1 моль/дм³ (0,1 н) раствора соляной кислоы Перед использованием кадмий декантацией промывают 0,1 ыолъ/дм (0,1 н) раствором соляной кислоты 3-4 раза по 200 см³, затем несколько раз дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге. При промывании следует отделять декантапией мелкие частицы кадмия, чтобы избежать в процессе работы чрезмерного уплотнения колонки и снижения скорости элюации.

Примечание: отделенные мелкие частицы кадмия следует хранить в вытяжном шкафу в склянке с притертой пробкой под слоем воды.