Определение активности пероксидаз в растительной
Продукции
При окислении в организмах кислородом органических субстратов в качестве основных продуктов образуются пероксид водорода (Н2О2) или органические пероксиды, которые могут окислять различные вещества. Одним из хорошо известных ферментов, способных катализировать реакции пероксидного окисления химических веществ в живых клетках, является пероксидаза (1.11.1.7.), которая с пероксидом водорода образует комплекс-ное соединение, в результате чего пероксид переходит в активированное состояние, превращаясь в акцептор водорода.
Растительные пероксидазы – двухкомпонентные ферменты, локализо-ванные главным образом в пероксисомах. В состав каталитического центра этих ферментов входит протогем. Действие пероксидазы можно представить в виде следующей реакции:
Субстрат–Н2 + Н2О2 ® окисленный субстрат + 2Н2О
Пероксидазы катализируют окисление пероксидом водорода феноль-ных соединений, жирных кислот, аминокислот и аминов, терпенов, восста-новленного глютатиона. Эти ферменты обладают высокой термоустойчи-востью, поэтому после стерилизации растительной продукции тепловой обработкой для последующего хранения и переработки в ней контролируется активность пероксидаз. При ферментации чая и табака пероксидазы наряду с полифенолоксидазами участвуют в образовании окрашенных и ароматизи-рующих веществ в составе этих продуктов.
Принцип метода.Определение активности пероксидаз в растительной продукции основано на проведении ферментативной реакции окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивают колориметрированием на фотоэлектроколориметре.
Оборудование.Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; марля для фильтрования; чашки фарфоровые диаметром 6-8 см; колбы конические на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 см; дозирующее устройство на 5 мл для раствора серной кислоты; мерные колбы на 100 мл и на 1 л с пробками; тёмная склянка для раствора пероксида водорода; термостат, фотоэлектроколориметр.
Реактивы.Дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода); концентрированный раствор пероксида водорода; концентрированная серная кислота; 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0); пирогаллол.
Приготовление растворов.1% раствор пероксида водорода: готовится свежий раствор перед каждым анализом путём разбавления концентрирован-ного раствора в мерной колбе на 100 мл. Приготовленный раствор перелива-ют в тёмную склянку.
10% раствор серной кислоты: в фарфоровый стакан на 500 мл наливают 300 мл дистиллированной воды, к которой с помощью дозирующего устройстваприливают 60,6 мл концентрированной серной кислоты, полу-ченную смесь перемешивают и после охлаждения переливают в мерную колбу на 1 л, ополаскивая стакан дистиллированной водой. Затем объём раствора в колбе доводят водой до метки и перемешивают.
0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0): в мерной колбе на 1 л дистиллированной водой растворяют 17,911 г Na₂HPO₄∙12Н₂О; в мерной колбе на 500 мл дистиллированной водой растворяют 3,901 г NaН₂РО₄∙2Н₂О. Затем 390 мл раствора NaН₂РО₄∙2Н₂О смешивают с 610 мл раствора Na₂HPO₄∙12Н₂О.
1% раствор пирогаллола: 5 г пирогаллола растворяют дистиллирован-ной водой в мерной колбе на 500 мл.
Ход определения.Навеску растительного материала 2 г (клубни картофеля, корнеплоды, проростки семян злаковых, зернобобовых, масличных культур, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений) взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0,01 г и растирают в ступке или измельчают в гомогенизаторе до получения однородной массы. В случае необходимости в ступку для лучшего растирания растительного материала добавляют небольшое количество чистого кварцевого песка. К измельчённому в ступке материалу приливают дозирующей пипеткой 20 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0) для экстракции ферментного белка и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Затем в фарфоровую чашку помещают уложенную в 4 слоя марлю и на неё переносят измельчённый растительный материал из ступки, заворачивают края марлевой ткани и отжимают через 4 слоя марли растительный экстракт с растворённым ферментным белком в коническую колбу на 50 мл.
В ходе последующего анализа в 2 конические колбы на 50 мл дозирующей пипеткой вносят по 4 мл ферментного экстракта и в одну из колб для инактивации ферментного белка (контроль) с помощью дозирующего устройства приливают 5 мл 10% раствора серной кислоты, смесь перемешивают. После этого в обе колбы дозирующей пипеткой приливают по 5 мл 1% раствора пирогаллола и по 1 мл 1% раствора пероксида водорода, смеси перемешивают и помещают на 15 минут в термостатированную камеру при температуре 25°С. Реакция проводится в отсутствие света, который активирует самопроизвольный распад пероксида водорода на кислород и воду. Отсчёт времени ферментативной реакции начинается в тот момент, когда к ферментному раствору приливается раствор пероксида водорода. По истечении 15 минут теперь уже в колбу с активным ферментом для его инактивации приливается 5 мл 10% раствора серной кислоты и в этот момент фиксируется точное время прекращения ферментативной реакции.
После проведения ферментативной реакции окрашенные растворы образующимся под действием пероксидаз пурпурогаллином колориметриру-ют на фотоэлектроколориметре с использованием зелёного светофильтра при толщине фотометрируемого слоя 5 мм.
Обработка и оценка результатов.Активность пероксидаз рассчиты-вают по формуле:
(D₁-D₂) ∙ 20
А = ¾¾¾¾¾¾¾ ,
Н ∙ 4 ∙ t
где А – активность пероксидаз в единицах оптической плотности раствора пурпурогаллина, образовавшегося за 1 час под действием этих ферментов в расчёте на 1 г растительной массы;
D₁ – оптическая плотность раствора в варианте с активными пероксидазами;
D₂ – оптическая плотность раствора в варианте с инактивированными пероксидазами;
20 – объём ферментного экстракта, выделенного из растительной пробы, мл;
Н – навеска растительного материала, г;
4 – объём экстракта пероксидаз, взятый для проведения ферментативной реакции;
t – время ферментативной реакции в часах.
Полученный результат сравнивают с другими определениями пероксидазной активности в различных растительных образцах и дают оценку происходящих в них биохимических процессов.
Контрольные вопросы
1. Каковы строение и механизм действия фермента пероксидазы?
2. Окисление каких веществ катализируют пероксидазы?
3. Какое значение имеют пероксидазы в обмене веществ организмов?
4. В чём состоят принципы определения каталитической активности пероксидаз?
5. Как выделяют пероксидазы из растительного материала и каковы особенности проведения ферментативной реакции пероксидного окисления пирогаллола?
6. Как проводят колориметрирование окрашенного раствора пурпурогаллина, образовавшегося под действием пероксидаз?
7. Каковы принципы расчёта активности пероксидаз?
8. Как можно использовать сведения об активности пероксидаз при оценке биохимических процессов в растениях и качества растительной продукции?