Определение белков биуретовым методом

Белки представляют собой высокомолекулярные биополимеры, молекулы которых построены из остатков протеиногенных аминокислот, соединённых пептидными связями. Протеиногенные аминокислоты отличаются тем, что они кодируются в структуре белков кодонами генетического кода. Однако под воздействием физиологической среды остатки некоторых протеиногенных аминокислот в молекулах белков могут подвергаться модификации, в ходе которой образуются их структурные аналоги. Если белковые молекулы содержат только остатки аминокислот, соединённые пептидными связями, их называют протеинами. Кроме амино-кислотных остатков молекулы белков могут включать другие группировки не аминокислотной природы и такие белки называют протеидами.

Белковые молекулы выполняют в организмах жизненно важные функции. Все биохимические реакции в клетках организмов происходят с участием каталитически активных белков – ферментов. Структурные белки участвуют в построении биологических мембран цитоплазмы и внутриклеточных органоидов. Активную роль в обмене веществ организмов играют регуляторные и транспортные белки, способные обратимо изменять конформацию своих молекул. Белки иммунной системы организма выполняют защитную функцию. В запасающих тканях растений откладываются запасные белки, которые служат источниками энергии и протеиногенных аминокислот для формирующихся проростков.

Белки в значительной степени определяют питательную ценность и технологические свойства растительной продукции. Они служат основными источниками незаменимых аминокислот для человека и животных. По средним нормам питания человеку необходимо потреблять 8-10 г полноценного белка в расчёте на 1 МДж обменной энергии, содержащейся в пище; коровам – 8-12 г, свиньям – 10-14 г, птице – 12-15 г. Обменная энергия – часть общей энергии пищи человека или корма животных, доступная для использования в процессе обмена веществ организма.

Учитывая важную роль белков в питании человека и кормлении сельскохозяйственных животных, содержание белков контролируется в растительной продукции и относится к наиболее важным показателям качества зерна злаковых и зернобобовых культур, семян масличных растений, клубней картофеля, корнеплодов, овощей, плодов и ягод, вегетативной массы кормовых трав и кукурузы. Много белков накапливается в зерне зернобобовых культур – 20-30%, в сое и люпине – 30-40%, в семенах масличных растений – 15-30%. Содержание белков в другой растительной продукции составляет, %:

Зерновки злаковых культур 8-18 Брюссельская капуста 5-6

Зерно кукурузы 8-11 Чеснок 6-8

Зерно риса 6-9 Плоды и ягоды 1-2

Клубни картофеля 1,5-2 Вегетативная масса (в расчёте на

Корнеплоды 1-1,5 сухое вещество перед цветением):

Овощи 0,5-2 бобовых трав 15-25

Цветная капуста 2-4 мятликовых трав 5-15

Количественное определение белков наиболее точно осуществляется методом Кьельдаля по белковому азоту, который умножают на коэффициент пересчёта в белки для соответствующего вида растительной продукции: зерно злаков – 5,7-5,8; зерно гречихи и зернобобовых культур – 6,0; семян масличных растений – 5,5; клубни картофеля, корнеплоды, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений – 6,25. Белковый азот определяют методом Кьельдаля после удаления из анализируемой пробы небелковых азотистых веществ и озоления в серной кислоте осадка растворимых белков, а также структурных белков растительного остатка.

Очень часто при оценке химического состава растительной продукции используют более простые и быстрые методы определения белков, в которых используются цветные реакции на белки. Одним из таких методов является биуретовый метод, способный обеспечивать достаточно высокую точность определения белков в растворе при их концентрациях от 0,04 до 2 мг/мл.

Принцип метода.Биуретовый метод основан на способности катионов меди (II) при взаимодействии в щелочной среде с группировками пептидных связей белков формировать устойчивые комплексы, окрашенные в сине-фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания зависит от концентрации белков в растворе. Количество белков в растворе определяют при сопоставлении оптической плотности анализируемого окрашенного раствора и набора окрашенных белковых растворов с известной концентрацией белков.

Оборудование.Баня водяная терморегулируемая; весы технические с точностью взвешивания ± 0,01 г; весы аналитические; центрифуга с набором центрифужных пробирок; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр с набором кювет; пипетки дозирующие на 1-10 мл; бюретки на 10-20 мл; ступки фарфоровые с пестиками диаметром 10 см; препаративный набор для измельчения растительного материала; мерные колбы с пробками на 50, 100, 200, 500 и 1000 мл; стеклянные стаканы на 150-200 мл; пробирки на 20 мл; воронки стеклянные диаметром 5-8 см; беззольные фильтры.

Реактивы.Спирт этиловый 96%; гидроксид натрия; мочевина; калий-натрий виннокислый; медь сернокислая (CuSO₄∙5H₂O); калий йодистый; уголь активированный; тимол; белок растительный чистый; вода дистиллиро-ванная (свободная от СО₂).

Приготовление растворов.0,2 М раствор NaOH: 8 г NaOH помещают в термостойкий стакан и растворяют в дистиллированной воде; после охлаждения полученный раствор переносят в мерную колбу на 1л, доводят объём в колбе до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

4% раствор NaOH: 4 г NaOH помещают в термостойкий стакан и растворяют в дистиллированной воде; после охлаждения полученный раствор переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят объём в колбе до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Спиртовой раствор щёлочи: в мерную колбу на 200 мл приливают 100 мл 96% этилового спирта и доводят объём в колбе до метки 4% раствором NaOH, затем содержимое колбы тщательно перемешивают.

Раствор мочевины: в химический стакан объёмом 1 л помещают 300 г мочевины и 0,5 г тимола, приливают 700 мл дистиллированной воды и полученную смесь нагревают до полного растворения мочевины и тимола; затем в раствор добавляют 3 г активированного угля, тщательно его перемешивают и фильтруют в мерную колбу на 1 л; объём раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Биуретовый реактив: 9 г калия-натрия виннокислого помещают в химический стакан и растворяют в 400 мл 0,2 М раствора NaOH, затем в полученный раствор добавляют 3 г сернокислой меди и перемешивают его до полного растворения внесённого реактива; на следующем этапе в образовавшийся раствор добавляют 5 г йодистого калия и полученную смесь перемешивают до полного растворения йодида калия (если необходимо смесь нагревают); после охлаждения полученный раствор переносят количественно в мерную колбу на 1 л с использованием 0,2 М раствора NaOH, доводят объём раствора в колбе до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают. Биуретовый реактив хранят в тёмной склянке.

Стандартный белковый раствор: 0,4 г чистого растительного белка растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл, в результате чего образуется белковый раствор с концентрацией белка 4 мг/мл.

Ход определения.Навеску растительного материала 1-2 г растирают в ступке до получения однородной массы, затем приливают 3 мл спиртового раствора щёлочи и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут для экстрагирования белков. После этого смесь из ступки переносят в центрифужную пробирку и подвергают центрифугированию с центробежным ускорением 5000 g в течение 10 минут. Прозрачную надоса-дочную жидкость в центрифужной пробирке переливают в стеклянную пробирку и далее используют для получения окрашенного раствора. Для этого в стеклянную пробирку на 20 мл с помощью дозирующей пипетки вносят 0,2 мл белкового раствора, выделенного из растительной пробы, и к нему из бюретки добавляют 2,4 мл раствора мочевины и 2,4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и затем пробирку выдерживают в течение 10 минут на водяной бане при температуре 40°С для формирования устойчивого окрашивания. После охлаждения окрашенный раствор колориметрируют на фотоэлектроколориметре или спектрофотомет-ре при длине волны 670 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см. После измерения оптической плотности окрашенного белкового раствора по градуировочному графику определяют количество белка в аликвоте 0,2 мл, взятой для приготовления окрашенного раствора.

Для построения градуировочного графика колориметрированию подвергаются окрашенные растворы с известной концентрацией белков. По вертикальной оси откладываются значения оптической плотности окрашен-ных растворов с известной концентрацией белков, а по горизонтальной оси количество белка в мг, содержащегося в 0,2 мл взятого для окрашивания белкового раствора. Набор растворов с известной концентрацией белков готовится в мерных колбах на 10 мл, в которые приливают соответственно 1,5, 2,5, 3,5, 4,5, 6, 8, 10 мл стандартного белкового раствора с концентрацией белков 4 мг/мл. Объём раствора в мерных колбах на 10 мл доводят до метки спиртовым раствором щёлочи и их содержимое тщательно перемешивают. Из каждой колбы отбирают по 0,2 мл белкового раствора и производят их окрашивание по выше указанной методике с использованием раствора мочевины и биуретового реактива. В каждой аликвоте белкового раствора объёмом 0.2 мл будет содержаться соответственно 0,12, 0,2, 0,28, 0,36, 0,48, 0,64, 0,8 мг белка.

Если оптическая плотность опытной пробы выходит за пределы граду-ировочного графика, то проводится повторное проведение окрашивания белкового раствора после его соответствующего разбавления. При этом не допускается разбавление окрашенного раствора, так как оно вносит ошибку в измерение оптической плотности.

Обработка и оценка результатов.Массовуюдолюбелков в анализируемой растительной пробе рассчитывают с учётом разбавления по следующей формуле:

Мб ∙ 3 ∙ 100

Х = ¾¾¾¾¾¾,

Н ∙ 0,1

где Х – содержание белков в анализируемой растительной пробе, %;

Мб – масса белков в 0,2 мл спиртового раствора, выделенного из растительной пробы, мг;

Н – навеска растительного материала, взятая для анализа, мг;

3 – общий объём выделенного из растительной пробы белкового раствора, мл;

0,2 – объём выделенного белкового экстракта, взятый для приготовления окрашенного раствора, мл;

100 – коэффициент пересчёта в проценты.

Полученный результат сравнивают с теоретическими данными и оценивают качество растительной продукции по данному показателю.

Контрольные вопросы

1. Какие функции выполняют белки в клетках организмов?

2. Какова роль белков в питании человека и кормлении животных?

3. Как различаются по содержанию белков различные виды растительной продукции?

4. Какими методами определяют содержание белков в растительной продукции?

5. Какие принципы положены в основу определения белков биуретовым методом?

6. Каковы особенности выделения белков из растительных проб для их количественного определения биуретовым методом?

7. Как проводится окрашивание белкового раствора с использованием биуретового реактива?

8. Какова методика построения градуировочного графика?

9. Как осуществляется расчёт массовой доли белков в анализируемой растительной пробе по результатам колориметрирования окрашенных белковых растворов с использованием биуретового реактива?

10. Какое влияние оказывают природно-климатические факторы и режим питания растений на содержание белков в растительной продукции?

Спектрофотометрический метод определения белков

В биохимических опытах очень часто возникает необходимость оцени-вать концентрацию в растворе белков на промежуточных этапах их изучения с сохранением нативных свойств белковых молекул для проведения дальней-ших исследований. Для этих целей разрабатываются модификации их коли-чественного определения с помощью спектрального анализа. Одним из таких методов является определение белков на основе измерения оптической плот-ности их растворов в ультрафиолетовом диапазоне при длине волны 280 нм.

Принцип метода.Метод основан на способности группировок арома-тических аминокислот в составе белковых молекул (тирозина, триптофана, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовое излучение при длине волны 280 нм.Белкивыделяют из растительной пробы соответствующим растворите-лем (вода, солевой раствор, щелочной буферный раствор и др.) с после-дующим центрифугированием и затем на спектрофотометре измеряют оптическую плотность полученного белкового раствора при длине волны 280 нм. Количество белков в растворе оценивают при сопоставлении оптической плотности анализируемого белкового раствора с оптической плотностью стандартного белкового раствора с известной концентрацией белков.

Если в анализируемом белковом растворе повышена концентрация нуклеиновых кислот, то они вносят ошибку в определение белков, так как способны поглощать ультрафиолетовое излучение при длине волны 280 нм, а максимум их поглощения наблюдается при длине волны 260 нм. Поэтому в данном случае спектрофотометрирование белкового раствора проводится при длинах волн 260 нм и 280 нм, а затем влияние нуклеиновых кислот на оптическую плотность белкового раствора исключается путём внесения соответствующей поправки.

Оборудование.Лабораторные весы; фарфоровые ступки с пестиками диаметром 6-8 см; центрифужные пробирки на 20 мл; среднескоростная центрифуга с центробежным ускорением до 15000 g; стеклянные пробирки на 20 мл; дозирующие пипетки на 0,1-1 мл, 1-5 мл; мерные колбы на 50, 100, 500, 1000 мл; стеклянные воронки диаметром 5-6 см; спектрофотометр с кварцевыми кюветами.

Реактивы.Натрий хлористый; белок растительный стандартный; вода дистиллированная.

Приготовление растворов.1% раствор хлорида натрия: 1 г хлорида натрия растворяют в 99 г дистиллированной воды и полученный раствор тщательно перемешивают.

Стандартный белковый раствор: в мерной колбе на 100 мл растворяют 100 мг растительного белка с использованием 1% раствора хлорида натрия, объём раствора в колбе доводят до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают.

Ход определения.Навеску растительного материала 1 г (зерно злако-вых, зернобобовых культур, семян масличных растений, картофель, корне-плоды, овощи, плоды и ягоды), взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка до получения однород-ной массы. К полученной смеси приливают 10 мл 1% раствора хлористого натрия и содержимое ступки интенсивно перемешивают в течение 15 минут. Затем смесь из ступки переносят в центрифужные пробирки и подвергают центрифугированию со скоростью 10-12 тысяч оборотов в минуту в течение 10 минут.

Полученный после центрифугирования белковый раствор переливают в стеклянную пробирку на 20 мл. Затем 0,2 мл этого раствора переносят дозирующей пипеткой в другую стеклянную пробирку на 20 мл, приливают 9,8 мл раствора хлорида натрия и содержимое пробирки тщательно перемешивают. Приготовленный таким образом разбавленный белковый раствор фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 280 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см. Затем по колибровочному графику определяют количество белков в анализируемом растворе.

Для построения калибровочного графика из стандартного белкового раствора путём разбавления готовят шкалу рабочих растворов с известной концентрацией белка. Для этого в 9 стеклянных пробирок на 20 мл вносят соответственно 0,1, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,2, 2,6 мл исходного стандартного белкового раствора, доводят объём раствора до 10 мл 1% раствором хлорида натрия и содержимое пробирок тщательно перемешивают. В приготовленных рабочих растворах будет содержаться соответственно 0,1, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,2, 2,6 мг белка. Рабочие белковые растворы фотометрируют по выше указанной методике при длине волны 280 нм и по полученным значениям оптической плотности строят колибровочный график.

Обработка и оценка результатов.Массовую долю белков в анализируемой растительной пробе рассчитывают по формуле:

Мб ∙ 10 ∙ 100

Х = ¾¾¾¾¾¾ ,

Н ∙ 0,2

где Х – массовая доля белков в растительной пробе, %;

Мб – масса белков в фотометрируемой пробе, определённая по калибро-вочному графику, мг;

10 – объём белкового экстракта, выделенный из растительной пробы, мл;

100 – коэффициент пересчёта в %;

Н – исходная навеска растительного материала, г;

0,2 – объём белкового раствора, взятый для приготовления фотометрируе-мой пробы, мл.

Если в анализируемой пробе содержатся нуклеиновые кислоты, концентрацию в ней белков определяют с учётом поправки на поглощение ультрафиолетового излучения нуклеиновыми кислотами по следующей формуле:

Сб = 1,45Е₂₈₀ - 0,74Е₂₆₀,

где Сб – концентрация белков в анализируемом растворе, мг/мл;

Е₂₈₀ – отсчёт оптической плотности белкового раствора, определённый при длине волны 280 нм;

Е₂₆₀ – отсчёт оптической плотности белкового раствора, определённый при длине волны 260 нм;

1,45 – поправка на поглощение нуклеиновыми кислотами;

0,74 – поправка на поглощение группировками ароматических амино-кислот, находящимися в составе белков.

Рассчитанную по указанной формуле концентрацию белков (мг/мл) умножают на объём раствора в пробирке (10 мл) и таким образом получают количество белков (Мб) в мг, которое содержится в 0,2 мл белкового экстракта, выделенного из навески растительного материала. Окончательный расчёт массовой доли белков в растительной пробе выполняется по исходной формуле, представленной на странице 44.

На основе полученного результата оценивают качество растительной пробы, её питательные, кормовые и технологические свойства.

Контрольные вопросы

1. В чём состоят особенности определения белков спектрофотометри-ческим методом?

2. Как выделяют белки из растительной пробы?

3. Как учитывают поправку на нуклеиновые кислоты при определении белков спектрофотометрическим методом?

4. Какие белки можно определять спектрофотометрическим методом?

5. По какой методике проводится фотометрирование белковых растворов?

6. Каковы особенности приготовления шкалы рабочих растворов с известной концентрацией белков?

7. В чём заключается преимущество спектрофотометрического метода определения белков по сравнению с другими методами?