Ксантопротеиновая реакция

Ксантопротеиновая реакция характерна для ароматических аминокислот и содержащих их полимеров, в том числе белков и пептидов. Ароматическое кольцо нитруется концентрированной азотной кислотой с образованием соединений желтого цвета. Этим объясняется появление желтых пятен на коже рук при попадании на них капель азотной кислоты. При добавлении щелочи окраска переходит в оранжевую.

Ход определения

В пробирку поместите 5 капель раствора белка и 3 капли концентрированной азотной кислоты; нагрейте. Отметьте появление жёлтого окрашивания. Прибавьте по каплям 20% раствор гидроксида натрия или аммония. Пронаблюдайте за изменением окраски. Дайте обоснование наличия ароматических аминокислот в исследуемом белке.

Реакция Фоля

Реакцию Фоля дают соединения, содержащие в молекуле меркаптогруппу, в том числе аминокислоты, включающие атомы серы, и белки. При нагревании со щелочью серосодержащие аминокислоты разрушаются с образованием сульфид-ионов, которые выпадают в осадок, взаимодействуя с ионами свинца. Осадок имеет темный цвет (черный или коричневый).

Ход определения

Поместите в пробирку 5 капель раствора белка (вместо него можно использовать кусочек ногтя или свернутый клубочком волос), прибавьте 5 капель 3% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца; прокипятите содержимое пробирки. Пронаблюдайте за изменениями; подведите итог.

Оформите отчет по работе. В протоколе укажите тему занятия, название лабораторной работы, кратко опишите принцип метода и ход определения, сделайте соответствующие выводы.

Контроль выполнения лабораторной работы

1. Каковы внешние признаки положительной биуретовой реакции?

2. Все ли белки дают биуретовую реакцию? Почему?

3. Укажите внешние признаки, которыми характеризуется реакция a-аминокислот с нингидрином?

4. Какое практическое применение имеет эта реакция?

5. Напишите уравнение реакции взаимодействия тирозина с концентрированной азотной кислотой. Какие еще a-аминокислоты, входящие в состав белков, могут вступать в эту реакцию?

6. Напишите схему реакции взаимодействия цистеина с ацетатом свинца. Приведите примеры белков, которые дают положительную пробу Фоля.

Темы рефератов:

1. Доменная организация некоторых белков.

2. Шапероны и их функции в клетке.

Лабораторно-практическое занятие № 2

Тема: Физико-химические свойства белков. Способы их очистки и разделения.

Цель: На основе знаний о строении белковых молекул изучить их способность к растворению в воде и солевых растворах, познакомиться с факторами стабильности белковых растворов, приемами очистки, осаждения, фракционирования и количественного определения протеинов, способами изучения индивидуальных белков, использованием в клинике реакций их необратимого осаждения.

Значение: Для ряда белков, представляющих медицинский интерес, существуют специализированные способы выделения и изучения, основанные на знании их физико-химических свойств. Важную роль в понимании физиологической функции различных классов протеинов играют представления об их физико-химических свойствах, приёмах обратимого осаждения и процессах денатурации, что дает возможность для применения этих знаний в медицинской практике. Например, липопротеины, определение которых имеет большую диагностическую ценность при атеросклерозе и ряде других патологических состояний, классифицируют в соответствии с их поведением в электрическом или гравитационном полях; некоторые белки можно разделить хроматографически или иммунологически; существуют достаточно точные методы определения молекулярной массы и количественного содержания протеинов в различных биологических жидкостях.

Исходный уровень

1. Особенности строения аминокислот, их классификация, химические и физические свойства.

2. Виды растворов, их свойства.

3. Зависимость растворимости от природы растворителя и растворяемого вещества.

4. Уровни организации белковых молекул.

5. Типы связей, стабилизирующих различные структуры.

6. Формы белковых молекул.

7. Кислотно-основные свойства органических соединений.

8. Особенности ионизации амино- и карбоксильных групп в молекулах аминокислот при различных значениях рН.

Вопросы для самоподготовки

1. Молекулярная масса белков; размеры и форма их молекул.

2. Физико-химические свойства протеинов: растворимость, ионизация, гидратация.

3. Коллоидные свойства и факторы стабильности белковых растворов.

4. Факторы, от которых зависит заряд белковых молекул в растворе — аминокислотный состав и рН среды.

5. Поведение белковых молекул в электрическом поле. Изоэлектрическая точка. Растворимость и электрофоретическая подвижность белков в изоэлектрической точке.

6. Электрофорез как метод разделения заряженных биополимеров.

7. Биологические свойства протеинов (лигандность, кооперативность, полифункциональность, специфичность).

8. Механизмы обратимого осаждения белков. Применение в медицине.

9. Денатурация белков, ее причины. Шапероны — защитники от денатурации в живом организме. Факторы, которые могут вызвать необратимое осаждение белков. Использование явления денатурации в медицине.

10. Методы выделения и очистки биополимеров (гомогенизация биологического материала, замораживание и оттаивание тканей, экстрагирование).

11. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии. Определение аминокислотного состава с помощью гидролиза и бумажной хроматографии. Промышленные аминокислотные анализаторы.

12. Очистка белковых растворов от низкомолекулярных примесей (диализ, высаливание).

13. Методы определения молекулярной массы биополимеров.

14. Способы количественного определения протеинов.

Литература

Основная

1. Лекция по биоорганической химии «Аминокислоты, пептиды, белки».

2. Лекция по биохимии «Физико-химические свойства белков».

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп.— М.: Медицина, 1998. — С. 19-28, 37-42.

4. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004.— С.35-37; 43-47; 53-59.

5. Ситуационные задачи по биохимии: Учебное пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов // Никитина Л.П., Гомбоева А.Ц., Соловьева Н.В. и др. – 2-е изд., испр. и доп. - Чита, 2003. – С. 4-5.

Дополнительная

1. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С.Северина. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2005 (2003). — С. 9-39.

2. Биологическая химия: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. завед / Под ред. Ковалевской. – М.: Издат. Центр «Академия», 2005. – С.6-9; 33-36.

3. Биохимия (в вопросах и ответах) (учебное пособие для студентов мед. вузов) / Т.П.Вавилова, О.Л.Евстафьева– М.: ВЕДИ, 2005. – С.5–13.

4. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Под ред. Е.С.Северина. – М.:ГЭОТАР-МЕД, 2001. – С.22-25; 29-32; 341-343.

5. Биохимия. Тесты и задачи: Учеб. пособие для студ. мед. вузов / Под ред. Е.С.Северина. – М.: ВЕДИ, 2005. – С.9-33.

6. Гринстейн Б., Гринстейн А. Наглядная биохимия: Пер. с англ. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – С. 112-115.

7. Щербак И.Г. Биохимия: Учебник. – СПб.: СПбГМУ, 2005. – С.34 -45.

8. Методы фракционирования, очистки и определения молекулярной массы белков. Методы количественного измерения белков (Методичка для самостоятельной работы).

Лабораторная работа