Количественное определение белков в плазме крови

На долю белков в плазме крови у взрослых приходится 6,5-8,5 % (или 65-85 г/л), у новорожденных -47-65 г/л, у 4-хлетних – 59-79г/л.

Принцип метода: Их общее количество можно определить с помощью метода, в основе которого лежит биуретовая реакция, т.е. способность пептидов образовывать с сульфатом меди в щелочной среде комплексное соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации протеинов в растворе и измеряется фотоэлектроколориметром.

Развитие гиперпротеинемии возможно при ревматизме, воспалительно-инфекционных заболеваниях за счёт роста вклада γ-глобулинов. Гипопротеинемия регистрируется при алиментарной дистрофии, нефритах, раковых заболеваниях, болезнях печени.

11. Количественное определение мочевины в крови

В норме 46 – 60% остаточного азота у здоровых людей приходится на долю мочевины, поэтому в настоящее время проводят определение именно этого компонента. В норме содержание мочевины в сыворотке крови составляет 2,5 – 8,3 ммоль/л. Увеличение ее концентрации в крови (гиперкарбамидемия) регистрируется при почечной патологии. При тяжелых заболеваниях печени, острых отравлениях лекарствами концентрация мочевины снижается. Методы определения содержания мочевины подразделяют на две основные группы: ферментативные (уреазные) и неферментативные. Первые являются более точными и специфичными.

Метод основан на способности уреазы гидролизовать мочевину с образованием аммиака, по уровню которого можно судить о концентрации мочевины в крови или других биологических жидкостях.

СО(NН₂)₂ + Н₂О уреаза NН₃ + СО₂

мочевина

Для установления содержания аммиака может быть применена реакция взаимодействия его с салицилатом натрия и гипохлоридом натрия в присутствии нитропруссида натрия, в результате которой образуется окрашенный продукт (зеленого цвета), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Реактивы:

Реагент 1 – раствор уреазы (40 ед. акт/мл)

Реагент 2 – раствор салицилата натрия (1,4 моль/л) и нитропруссида натрия (0,2 моль/л)

Реагент 3 – растволр гипохлорита натрия (75 ммоль/л) и гидроокиси натрия (0,56 моль/л)

Принцип метода: К 0,5 мл реагента № 1 добавляют 0,01 мл сыворотки крови, выдерживают 5 минут при 37 и приливают по 2 мл реагентов 2 и 3. Через 5 минут измеряют оптическую плотность растворов опытной и калибровочной проб против контроля при 640 нМ. Расчет производят по формуле: С_оп=Е_оп/Е_ст*С_ст, где – С_ст – концентрация стандартного раствора мочевины; Еоп – оптическая плотность опытного раствора; Ест – оптическая плотность стандартного раствора мочевины.

При ряде патологических состояний этот показатель увеличивается (гиперазотемия).

Ретенционная гиперазотемия развивается в результате недостаточного выделения с мочой азотсодержащих продуктов при нормальном поступлении их в кровь (в основном за счёт мочевины при ослаблении экскреторной функции почек или при тяжёлой недостаточности кровообращения, и препятствии оттоку крови). Продукционная гиперазотемия наблюдается при избыточном выходе из тканей в кровь азотсодержащих продуктов (при усиленном распаде тканевых белков, при ранениях, ожогах, кахексии, заболеваниях печени, экссудативном диатезе у детей и т.д.).

Так как мочевина вносит основной вклад в состав небелкового азота, то в клинике часто используют различные способы ее определения в сыворотке крови. В основе одного из них лежит способность этого соединения образовывать с диацетилмонооксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и солей железа окрашенные вещества, интенсивность пигментации которых пропорциональна содержанию карбамида в сыворотке крови (в норме 5-8 ммоль/л). Повышенное содержание карбамида в крови – гиперкарбамидемия.

12. Методы исследования белков (хроматография, электрофорез, гель-фильтрация, рентгеноструктурный анализ и др.)

Работы, которые нужно проделать практически:

1. Цветные реакции на аминокислоты, пептиды, белки:

а) Биуретовая реакция

В пробирку внесите 5 капель исследуемого раствора (1 % раствор белка), добавьте 10 капель 10 % раствора NаОН и 1 каплю 1 % раствора сульфата меди. В присутствии пептидов, имеющих 2 и более амидные связи, появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Реакция обусловлена образованием стабильного биуретового комплекса за счёт координационных связей.

б) Нингидриновая реакция

В пробирку внесите 5 капель исследуемого раствора (1 % р-р белка), добавьте 3 капли 0,5 % раствора нингидрина, нагрейте до кипения. Через 2-3 мин смесь окрашивается в розовый, затем красный или красно-фиолетовый цвет за счёт взаимодействия нингидрина с α-аминокислотами.

Это объясняется распадом аминокислот на соответствующие альдегиды, диоксид углерода и аммиак. Две молекулы нингидрина (восстановленная и окисленная) конденсируясь с аммиаком, образуют краситель.

в) Реакция Фоля

С помощью этой реакции доказывается наличие серосодержащих аминокислот. В пробирку внесите 5 капель исследуемой жидкости, добавьте 5 капель 3 % раствора NаОН и 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца. Смесь нагрейте, при интенсивном кипячении жидкость темнеет за счёт образования сульфида свинца.

Это обусловлено разрушением цистеина, цистина и метионина при нагревании со щелочью и образованием сернистого натрия (Nа₂SO₃). При взаимодействии уксуснокислого свинца со щёлочью образуется плюмбит натрия, который с Nа₂SO₃ даёт чёрный осадок.

2. Необратимые реакции осаждения белков (денатурация):

а) Осаждение белков при нагревании

В три пробирки налейте по 2 мл раствора белка. Нагрейте содержимое 1-ой пробирки. Образуется осадок протеинов вследствие их тепловой денатурации. Во вторую пробирку добавьте 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и тоже нагрейте. Осадок выпадает скорее и полнее, т.к. протеины в слабокислой среде находятся в изоэлектрическом состоянии и легче агрегируются. В третью пробирку прилейте 0,5 мл 10% раствора уксусной кислоты и нагрейте. Осадка не образуется даже при кипячении, т.к. происходит изменение заряда на противоположный знак. А частицы, имеющие одноимённые заряд, не способны к склеиванию.

б) Осаждение белков минеральными кислотами

В три пробирки налейте по 1 мл концентрированных кислот – соляной, серной, азотной. Осторожно наслоите во все сосуды по 1 мл сыворотки. На границе двух жидкостей появляется белое кольцо, т.к. в белке под действием минеральных кислот происходит изменение рН среды (изоэлектрическая точка). Реакция с азотной кислотой называется пробой Геллера(см. ниже) и применяется в клинике для доказательства белка в моче.

в) Осаждение белков органическими растворителями

В две пробирки налейте по 1 мл сыворотки и добавьте в первую – несколько капель 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а во вторую – немного сульфосалициловой кислоты. Наблюдается выпадение осадка. Органические вещества способны взаимодействовать с функциональными группами протеинов, что приводит к разрыву дополнительных связей, стабилизирующих вторичную и третичную структуры нативных белков, и образованию новых.

г) Осаждение белков солями тяжёлых металлов

В три пробирки налейте по 1 мл раствора белка. Прибавьте в первую 2-3 капли 5% раствора уксуснокислого свинца (Pb(CH₃COO)₂), во вторую - 3-4 капли 1н. раствора сернокислой меди, в третью - 2-3 капли 3% раствора хлорного железа. Затем содержимое пробирок взболтайте и добавьте в каждую по 3-4 мл воды. Докажите, что во всех случаях осадок в воде нерастворим. Соли тяжёлых металлов (меди, ртути, серебра, свинца и т.д.) образуют прочные связи с функциональными группами белков (чаще всего с – SН), изменяя их конформацию.

д) Осаждение белков алкалоидными реактивами

В две пробирки налейте по 2 мл сыворотки, в одну добавьте несколько капель 0,5 н. соляной кислоты, а затем по каплям 3% раствор жёлтой кровяной соли до образования осадка белка. Во вторую пробирку внесите 2-3 капли танина. Образуется осадок, не растворяющийся в воде. Происходит агрегация молекул.

Сравните полноту осаждения белков разными реагентами.