Глюкозооксидаза (1.1.3.4)
Это двухкомпонентный фермент, содержащий в качестве простетической группы две молекулы флавинаденидинуклеотида (ФАД). Этот фермент катализирует дегидрирование глюкозы и перенос отнятого водорода на кислород воздуха с образованием пероксида водорода. При этом глюкоза превращается в глюконолактон:
| СН2ОН | СН2ОН | ||||
| Н ½ О ОН | Н ½ О | ||||
| Н | + О2 | Н С = О | |||
| ОН Н | ¾¾¾¾¾¾> | ОН Н + | Н2О2 | ||
| НО Н | НО | ||||
| Н ОН | Н ОН | ||||
| b - D- глюкопираноза b - глюконолактон |
В живых клетках и неочищенных ферментных препаратах, используемых в промышленности, глюкозооксидаза всегда присутствует с глюконолактоназой и каталазой, глюконолактон превращается в глюконовую кислоту:
| СН2ОН | СН2ОН | |
     Н ½ О | Н ½ ОН | |
       Н С = О | глюконолактоназа | Н СООН |
   ОН Н +Н2О | ОН Н | |
   НО | НО | |
| Н ОН | Н ОН | |
| глюконолактон D - глюконовая кислота |
Пероксид водорода разлагается каталазой:
каталаза
2 Н2О2 ¾¾¾¾¾¾¾¾> 2 Н2О + О2
Так как очищенные препараты глюкозооксидазы взаимодействуют практически лишь с глюкозой, она является одним из важнейших ферментов, применяемых в пищевой технологии и клинической биохимии для определения сахара.
Глюкозооксидаза используется в пищевой промышленности как для удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода, при производстве сухого яичного порошка, пива, вина, соков, майонеза. Для удаления кислорода из продуктов, содержащих жир, упаковочный материал - синтетическую пленку - пропитывают глюкозооксидазой, глюкозой и буфером.
Определение глюкозы с использованием фермента
Глюкозоксидазы
Принцип метода. Глюкозоокидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием глюконовой кислоты и пероксида водорода:
Глюкозоокидаза
С6Н12О6 + Н2О+О2 ¾¾¾¾¾¾¾®С6Н12О7 + Н2О2
Перекись водорода под действием другого фермента–пероксидазы – окисляет какой–либо хромогенный субстрат с образованием окрашенного соединения. Обычно используют о–дианизидин:
|
Продукт окисления в сильно кислой среде имеет интенсивную окраску. Метод позволяет избирательно определить содержание глюкозы в присут-ствии любых других сахаров.
Ход работы. Раствор 3 доводят до температуры 18–25 °С. В обычные пробирки помещают по 2 мл этого раствора, добавляя по 0,1 мл раствора глюкозы и оставляют при температуре 18–25 °С в темноте (во избежании фотоокисления) на 1,5 ч. Параллельно ставят 2 контрольных опыта (по 0,1 мл воды) и один стандарт (0,1 мл стандартного раствора глюкозы). По окончании реакции во все пробирки добавляют по 2 мл 16 н. раствора Н2SО4 и тщательно перемешивают растворы. Интенсивность окраски стандартного раствора и обычных проб измеряют на ФЭКе против контроля при 530 нм. Содержание глюкозы определяют, сравнивая поглощение опытного Dоп и стандартного Dст растворов:
, (1)
где Сх – содержание глюкозы, мкг/мл;
Dоп – экстинкция (оптическая плотность) опытной пробы;
Dст– экстинкция (оптическая плотность) стандартного раствора.
Диапазон чувствительности метода: 20 – 150 мкг/мл глюкозы.
Материалы и реактивы: раствор 1 - раствор ферментов (см. Приложение В, п.5); раствор 2 - о–дианизидина в воде, концентрация 4,75 мг/мл. Растворы 1 и 2 хранят в холодильнике до 6 месяцев, перед определением готовят раствор 3 (см. Приложение В, п.6); 16 н. раствор Н2SО4; стандартный раствор глюкозы 150 мг/мл.
Оборудование: пробирки; пипетки; черная бумага; аптечные резинки; фотоэлектроколориметр.