Компартментализация ферментов в клетке
Этот способ регуляции характерен только для высших форм живых организмов и позволяет осуществить наиболее тонкую регуляцию метаболизма. Он направлен на снижение скорости процесса за счет разъединения субстрата с ферментами с помощью мембраны. Перенос групп атомов и субстратов осуществляется за счет челночных механизмов, переводящих субстрат в форму, которая способна проникать через мембрану. Затем по другую сторону мембраны происходит обратное их превращение в первоначальную форму.
Контрольные вопросы
1. Строение активного центра фермента.
2. Молекулярные механизмы ферментативного катализа.
3. Мультисубстратные комплексы.
4. Количественные характеристики ферментативной активности. Единицы активности ферментов.
5. Факторы, влияющие на активность ферментов.
6. Регуляция активности ферментов.
Литература
1. Страйер Л. Биохимия в 3 т., «Мир», М., 1984
2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993
3. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, ОКФА, Одесса, 1994
4. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996
5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998
6. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000
7. Северин Е.С., Биохимия, «Гэотар-мед», М., 2004.
8. Комов В.П. Биохимия, М.: Дрофа, 2004.
9. Чиркин А.А., Практикум по биохимии, «Новое знание», Минск, 2002.
10. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д., Биологическая химия, «Бином», М., 2008.
Дополнительная литература
1. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004.
2. Metzler D., Biochemistry, (The chemical reactions in living cells), Elsevier, Academic Press, V. 1-2, 2003-2004.
3. Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006.
Ход работы
| Цель работы: | Характеристика факторов, влияющих на активность ферментов на примере гидролитического расщепления крахмала под действием амилазы слюны |
| Задание I | Изучить влияние физических и химических факторов на активность амилазы слюны |
*Определение оптимального значения рН среды для активности амилазы слюны
1. В четыре пробирки вносят по 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси с определенным рН по схеме, указанной в таблице:
| № пробирки | ||||
| рН буфера | 4.0 | 5.4 | 6.8 | 8.0 |
2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала и по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны.
3. В пятую пробирку (контрольная проба) вносят 2 мл дистиллированной воды и 1мл разведенного препарата амилазы слюны.
4. Каждую пробирку помещают в термостат и инкубируют при температуре 38°С в течение 10 мин.
5. Затем в каждую пробирку быстро добавляют по несколько капель раствора I2 и спектрофотометрически определяют оптическую плотность растворов относительно контрольной пробы при l = 620 нм.
6. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:
| № пробирки | рН буфера | А620 |
| 4.0 | ||
| 5.4 | ||
| 6.8 | ||
| 8.0 |
*Зависимость скорости ферментативного гидролиза крахмала амилазой слюны от температуры.
1. В четыре пробирки вносят по 1мл фосфатного буфера рН 6,8 и по 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала.
2. В пятую пробирку (контрольная проба) вносят 1мл фосфатного буфера рН 6,8 и 1 мл дистиллированной воды.
3. Пробирку №1 помещают в ледяную баню, пробирку №2 оставляют при комнатной температуре, пробирку №3 помещают в термостат при 38°С, пробирку №4 – в сильно кипящую водяную баню и пробирку №5 оставляют при комнатной температуре.
4. Через 5 минут в каждую пробирку добавляют по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны и тщательно перемешивают содержимое. Каждую пробу инкубируют в тех же условиях в течение 10 мин.
5. Затем в пробирки добавляют по одной капле раствора I2 и определяют оптическую плотность растворов относительно контрольной пробы при l = 620 нм.
6. Полученные результаты вносят в таблицу.
| № пробирки | Температура среды | А620 |
| Низкая | ||
| Комнатная | ||
| 38°С | ||
| 100°С |
| Задание II | Изучить влияние количества амилазы в реакционной смеси на скорость реакции и определить субстратную специфичность амилазы |
*Зависимость скорости ферментативной реакции от количества фермента
1. В четырех пробирках готовят разведение раствора амилазы слюны по следующей схеме:
- В первую пробирку вносят 2 мл исходного раствора амилазы слюны (разведение в 20 раз), во все остальные пробирки добавляют по 1 мл дистиллированной воды;
- 1 мл раствора из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 40 раз);
- 1 мл раствора из второй пробирки переносят в третью пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 80 раз);
- 1 мл раствора из третьей пробирки переносят в четвёртую пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 160 раз);
- Из четвертой пробирки отбирают 1 мл раствора и отбрасывают.
2. В каждую из четырех пробирок вносят по 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси рН 6,8.
3. В первую пробирку добавить 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала.
4. В каждую последующую пробирку, кроме пятой (контрольной), добавление 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала осуществляют строго по секундомеру через 3 минуты.
5. В пятую пробирку (контрольная проба) вносят 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси рН 6,8 и 1 мл дистиллированной воды.
6. Пробирки немедленно помещают в термостат. Каждую пробу инкубируют при температуре 38-40°С в течение 10 мин.
7. В первую и пятую пробирки добавляют по одной капле раствора I2 и определяют оптическую плотность растворов при l = 620 нм.
8. Затем через каждые 3 минуты по секундомеру добавляют в последующие пробирки по одной капле раствора I2 и определяют оптическую плотность растворов относительно контрольной пробы.
9. Результаты опыта представляют графически, откладывая по оси абсцисс относительную концентрацию амилазы, а по оси ординат значения относительной оптической плотности раствора при l = 620 нм.
*Специфичность действия амилазы
1. В одну пробирку вносят 2 мл 0.25%-ного раствора крахмала, во вторую – 2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Затем в пробирки добавляют по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны и перемешивают содержимое.
2. После инкубации в термостате при температуре 38-40°С в течение 10 мин пробирки охлаждают и определяют в них содержание глюкозы по реакции Троммера:
- для определения содержания глюкозы из каждой пробирки отбирают по 3 мл раствора;
- добавляют по 1 мл 10% раствора NaOH и по 5 капель 1% раствора CuSO4;
- пробирки нагревают до появления окраски;
- наличие окрашивания свидетельствует о присутствии глюкозы в анализируемой пробе.
3. Полученные результаты представить в виде следующей таблицы:
| № пробирки | Субстрат | Проба Троммера | |
| 1. | Крахмал | ||
| 2. | Сахароза |
Оформление работы
К занятию:
1. Кратко законспектировать теоретические материалы по лабораторной работе.
Во время занятия:
2. Описать этапы работы.
3. Оформить результаты в виде графиков и таблиц.
4. Сделать выводы по каждому из опытов