Осаждение белков нейтральными солями (высаливание)
Лабораторная работа
РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ
Большинство белков относятся к высокомолекулярным соединениям, которые хорошо растворяются в воде. Растворение белков в воде связано с гидратацией его молекул и образованием вокруг частиц белка гидратной оболочки. Любые физические и химические факторы, нарушающие гидратацию молекул белка и нейтрализующие их заряд, приводят к понижению растворимости белка и способствуют выпадению его в осадок.
1. Осаждение белков при нагревании.
Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой нарушается вторичная, третичная и четвертичная структуры белка. Свертывание большинства белков начинается при температуре 50-550С. При кратковременном нагревании денатурация может и не произойти или проявится в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры ведет к быстрому свертыванию белка.
На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и присутствие электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждение белков при кипячении практически не происходит, так как молекулы белка приобретают положительный или отрицательный заряды соответственно.
Реактивы: водный раствор яичного белка, 1 и 10%-ные растворы уксусной кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор хлорида натрия.
Выполнение работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения, при этом раствор мутнеет, но осадок не выпадает.
К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают, при этом выпадает хлопьевидный осадок белка.
К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения, при этом осадок не образуется.
В четвертую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения - белок выпадает в осадок.
В пятую пробирку добавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения, при этом осадок не выпадает.
Объяснить наблюдаемые явления, если известно, что в состав яичного белка входят: яичный альбумин с рНИЭТ = 4,8 и яичный глобулин с рНИЭТ = 6,6.
Осаждение белков органическими растворителями.
Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) разрушают гидратную оболочку белка, что приводит к понижению его устойчивости и выпадению белка в осадок.
Осаждение белков этанолом обратимо при кратковременном воздействии реагента и без нагревания. Длительный контакт белка со спиртом приводит к необратимой денатурации.
Реактивы: раствор яичного белка, этиловый спирт, ацетон.
Выполнение работы. К 1 мл раствора белка прибавляют 2 мл этилового спирта и взбалтывают. Выпадает осадок белка, который вновь растворяется при разбавлении водой.
К 1 мл того же раствора белка прибавляют 2 мл ацетона и энергично встряхивают. Раствор белка мутнеет.
Осаждение белков минеральными кислотами.
Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом возможно образование комплексных соединений. Все это приводит к необратимой денатурации белка. Осадок белка, полученный под действием кислот, в избытке серной и соляной кислоты растворяется, но не растворяется в избытке азотной кислоты.
Реактивы: раствор яичного белка, концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот.
Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора кислот: в первую – соляной, во вторую - серной, в третью – азотной. Осторожно по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешивались, приливают равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого кольца. Пробирки осторожно встряхивают, добавляют избыток кислот и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках.
Осаждение белков солями тяжелых металлов.
Белки осаждаются солями свинца, ртути, серебра, меди и других тяжелых металлов. В этом случае денатурация белка вызывается адсорбцией ионов тяжелых металлов на поверхности белковых молекул с образованием нерастворимых комплексов.
Избыток некоторых солей (сульфата меди, ацетата свинца и других) ведет к растворению осадка (пептизации).
Реактивы: раствор яичного белка, 1%-ный раствор сульфата меди, 5%-ный раствор ацетата свинца, 1%-ный раствор нитрата серебра.
Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора яичного белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую – сульфата меди, во вторую – ацетата свинца, в третью – нитрата серебра до выпадения осадков. Затем прибавляют избыток солей и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках. Осадок, образованный нитратом серебра, не растворяется в избытке соли.
Осаждение белков нейтральными солями (высаливание).
Выпадение белков в осадок при действии на них растворов нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов называется высаливанием. Этот процесс основан на дегидратации белков и нейтрализации зарядов белковых частиц адсорбирующимися на них ионами соли. При этом белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются и выпадают в осадок.
Изменяя концентрации солей, можно выделить различные белковые фракции. Так, в случае высаливания хлоридом натрия, глобулины (pHИЭТ = 6.6) осаждаются насыщенным раствором соли, а для осаждения альбуминов (pHИЭТ = 4.8) необходимо добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты для нейтрализации заряда белка.
Реактивы: раствор яичного белка с хлоридом натрия, кристаллический хлорид натрия (тонко растертый порошок в виде пудры), 1%-ный раствор уксусной кислоты, 1%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди.
Приготовление раствора белка (с добавлением хлористого натрия).
Белки трех куриных яиц отделяют от желтков, растворяют в 7 мл дистиллированной воды и приливают 3 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.
Выполнение работы. В пробирку наливают 3 мл раствора яичного белка и добавляют до получения насыщенного раствора порошок хлорида натрия. Через 5-6 минут в пробирке наблюдается выпадение осадка глобулинов. Альбумины из нейтральных растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются. Содержимое пробирки отфильтровывают через бумажный фильтр.
В фильтрате остаются альбумины, для их осаждения раствор подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Появившийся осадок отфильтровывают, а в фильтрате с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.
Контрольные вопросы.
1. Дайте понятие нативного белка.
2. Какие факторы влияют на растворимость белков?
3. Что происходит при обратимом и необратимом осаждении белков?
4. Какими реактивами вызывается необратимое осаждение белков?
5. Какие органические растворители вызывают осаждение белков из растворов и почему?
6. Как влияет изоэлектрическое состояние на осаждение белков при нагревании?
7. Какие факторы вызывают денатурацию белков и почему?
8. Почему при тепловой денатурации яичного белка в сильно кислой или сильно щелочной среде белок не выпадает в осадок даже при нагревании?
9. На чем основано разделение альбуминов и глобулинов?
10. На чем основан метод высаливания белков?
11. Предложите способ осаждения белков: пепсина (рНИЭТ=1,1), уреазы (рНИЭТ=4,9), каталазы (рНИЭТ=6,7).
12. На чем основаны методы извлечения белков?