Занятие 3. Структура и физико-химические свойства белков. Высаливание белков.

Цель:Изучить уникальную структуру белков, их основные физико-химические свойства и функции. Познакомиться с принципами современных методов исследования белков.

Студент должен знать:

1.Функции белков.

2. Чем обусловлена способность белка специфично связываться с различными веществами (лигандами).

3. Уровни организации белковой молекулы и связи их обусловливающие.

4. Содержание понятий «домен», «фолдинг», «шаперон».

5. Чем обусловлена растворимость белка в воде и факторы, влияющие на растворимость белка.

6. От чего зависит заряд белковой молекулы, содержание понятий «изоэлектрическая точка», «изоэлектрическое состояние».

7. Факторы, снижающие растворимость белка, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.

8. Принцип разделения белков методом электрофореза.

10. Понятие «нативный» и «денатурированный белок»

11. Факторы, вызывающие денатурацию белка. Применение денатурирующих агентов в медицине.

12. Принципы классификации белков. Примеры.

13. Общая характеристика представителей отдельных классов простых белков.

Студент должен уметь:

1. Дифференцировать факторы, вызывающие осаждение белка, на факторы, вызывающие денатурацию и факторы, вызывающие осаждение нативного белка.

2. Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») прогнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.

Студент должен получить представление:

1.О патологии, связанной с нарушением биосинтеза белка и фолдинг процесса.

2. Об использовании в медицинской практике свойства белков осаждаться тяжелыми металлами.

3. О принципах методов гельфильтрации, гельхроматографии.

4. О принципах современных методов количественного определения белка.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1.Знания о процессах растворения и диссоциации.

2. Осмотическое давление, его связь с ионным составом и концентрацией ионов.

3. Понятие о началах термодинамики.

4. Знания о принципах и технике колориметрии, спектрофотометрии и нефелометрии.

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1. Заполните таблицу: Уровни организации белковой молекулы:

Уровень организации	Типы связей	Функциональные группы, участвующие в образовании связей	аминокислоты, участвующие в образовании этих связей
первичный вторичный третичный четвертичный

2. Какие белки называют олигомерными? Определите понятие «протомер»

3. Чем обусловлено многообразие белков?

4. На каком этапе формирования белковой молекулы необходимы шапероны? Что может произойти с молекулой белка при их отсутствии в клетке?

5. Запишите функциональные группы аминокислот, обусловливающую амфолитную природу белковой молекулы, выделяя важнейшие и второстепенные.

6. Напишите формулу трипептида, имеющего суммарный положительный заряд при рН 7,0.

В какой среде (нейтральной, кислой, щелочной) лежит ИЭТ (изоэлектрическая точка) данного пептида?

7.ИЭТ пептида равна 5,0. Какие аминок-ты преобладают в составе пептида?

8. Напишите формулы трипептида, содержащего вал, ала, глю и трипептид, содержащий глю, асп, вал. Сравните степень их растворимости; подчеркните фрагменты молекул, определяющие их растворимость.

9. Заполните таблицу: Факторы, вызывающие осаждение белка:

Факторы, вызывающие осаждение нативного белка	Факторы, вызывающие денатурацию

10. Составьте таблицу по образцу: Классификация белков:

Принцип классификации	Название классов (групп)	представители и их функции
1.Наличие простетической группы в составе молекулы белка. 2. ?	простые (протеины) сложные (протеиды)	?

Аудиторная работа

Лабораторная работа

1. Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммонияможет использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины – при 100%-ном насыщении.

Ход работы:В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать – на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.

Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду – происходит растворение осадка.

В протоколе укажите принцип метода высаливания

2. Количественное определение белка в биологической жидкостиосновано на реакции осаждения белка сульфосалициловой кислотой и определении мутности осадка (нефелометрическое определение).

Ход работы: А. Опытная проба – в пробирку внести 1,25 мл исследуемой жидкости и добавить до 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты; экспонировать 5 мин; внести пробу после экспозиции в кювету (10мм) фотоэлектроколориметра и определить (против воды) плотность образовавшейся мути, используя оранжевый фильтр.

Б. Контрольная проба: внести в пробирку вместо сульфосалициловой кислоты 1,25 мл дистиллированной воды и далее провести все манипуляции опытной пробы.

Найти разницу между оптической плотностью опытной и контрольной проб и учесть результат по калибровочному графику.

Калибровочный график строится по результатам определения оптической плотности растворов альбумина с известной концентрацией при добавлении к ним сульфосалициловой кислоты: на оси абцисс – значения концентрации белка (в %), на оси ординат – значения оптической плотности (единица измерений экстинции).

Дайте обоснованные ответы:

1. Как узнать, осажден ли полностью белок из биологической жидкости после 50% насыщения ее сульфатом аммония?

Дополнительные сведения: жидкость после 50% насыщения сульфатом аммония и фильтрования прозрачна.

2. Как используя биуретовый метод определения белка и сульфат аммония, установить соотношение между альбуминами и глобулинами сыворотки крови?

3. Раствор белка кипятили 1,5 часа в присутствии серной кислоты. Будет ли биуретовая реакция на продукты положительной? Ответ аргументировать.

4. Запишите формулу пептида: ала-глу-асп-лиз-мет.

а. Определите суммарный заряд пептида при рН 7,0;

Как суммарный заряд влияет на растворимость?

б. в какой среде лежит ИЭТ данного пептида;

в. при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида?

5. Почему кислое молоко в отличие от свежего сворачивается (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок). В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

6. Почему протамины и гистоны коагулируют при нагревании в сильно щелочной среде?

7. Определите направление движения в электрическом поле двух пептидов при рН 7,0 ( при электрофорезе – к катоду или аноду):

а) вал- глу- ала б. лей-асп-арг

8. Подберите к методу разделения и очистки белков их соответствующие свойства, на которых основан данный метод:

1. Гель-фильтрация; А. Различия по величине заряда

2. Электрофорез; Б. Различие по молекул. массе

3. Афинная хроматография; В. Оба

4.Ионнообменная хроматография Г. Ни одно из свойств

9. Денатурация белка сопровождается (отметьте правильные ответы):

а. Разрывом ковалентных связей

б. Изменением пространственной конформации белка

в. Уменьшением растворимости белка