ЗАНЯТИЕ 4 Леч.. пед.. ф-т ы 2006

Тема: Бактериологический метод исследования. 2 этап бактериологического метода выделения аэробов.

Методы культивирования анаэробов. 1 этап бактериологического метода выделения анаэробов.

Цель:

1. Освоить II этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

2. Знать особенности метаболизма анаэробных микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях.

Знать:

1. Цель и последовательность выполнения II этапа бакметода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.

2. Способы культивирования анаэробных микроорганизмов: физические, химические, биологические, комбинированные.

Уметь:

1. Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

2. Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

3. Провести посев исследуемого материала на среду накопления (СКС).

Контрольные вопросы:

1. Сущность бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний; цель и последовательность выполнения I этапа бак. метода выделения аэробов.

2. Цель и последовательность выполнения II этапа бак. метода выделения аэробов.

3. Культуральные свойства микроорганизмов; методика изучения колоний.

4. Энергетический метаболизм бактерий и его особенности у аэробных, факультативно-аэробных и анаэробных бактерий.

5.Особенности культивирования анаэробных бактерий. Среды, методы и приборы, используемые для их культивирования

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести II этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:

- изучить результаты посева исследуемого материала, отобрать изолированные колонии различных типов и дать их характеристику;

- приготовить из колоний мазки, окрасить по Граму, промикроскопировать;

- посеять изолированные колонии различных типов на скошенный агар.

2. Провести I этап бактериологического метода выделения анаэробов:

- посеять почвенную болтушку на среду для контроля стерильности (СКС.)

3. Ознакомиться:

3.1. с приборами для культивирования анаэробов (микроанаэростат, эксикатор)

3.2. с методами культивирования анаэробов (Фортнера, Перетца, Виньяль-Вейона, Биттнера, газ-пак (Generbag anaer, фирма “bio-Meriux”,Франция))

3.3. со средами для культивирования анаэробов (Китта-Тароцци, полужидкий сахарный агар, среда для контроля стерильности).

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведение II этапа бактериологического метода выделения аэробов.

Для оценки результатов посева исследуемого материала просмотрите чашки и, если имеются различные виды колоний, пронумеруйте их и изучите в отдельности.

1.1. Методика изучения культуральных свойств изолированных колоний:

1) Вначале просматривают колонии невооруженным глазом (макроскопически) со стороны дна чашки в проходящем свете. В протоколе отмечают:

а) форму (круглая, овальная, неправильная и т.д.);

б) величину (точечные – менее 1 мм, мелкие – 1-2 мм, средние – 2-4 мм, крупные 4-5 мм и более);

в) прозрачность (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные).

2) Далее описывают колонии в отраженном свете со стороны крышки, отмечая:

а) поверхность (гладкая, складчатая, шероховатая; блестящая, тусклая и т.д.);

б) рельеф (плоская, выпуклая, кратерообразная и т.д.);

в) цвет колонии (бесцветная, пигментированная, с указанием цвета).

3) Для микроскопического изучения колоний чашку помещают вверх дном на предметный столик микроскопа, опускают конденсор и с объективом x 8 изучают:

а) края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые и т.д.);

б) структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая и т.д.).

4) При взятии биомассы из колонии для дальнейшего исследования определяют консистенцию (пастообразная, слизистая, крошащаяся и т. д.).

1.2. Для изучения морфо-тинкториальных свойств из изучаемых колоний приготовьте фиксированные препараты, окрасьте по Граму, промикроскопируйте и полученные результаты занесите в протокол.

На основании результатов изучения первичного посева исследуемого материала и отбора изолированных колоний сделайте вывод.

1.3. Для выделения и накопления чистой культуры оставшуюся часть колонии снимите петлей и засейте штрихом на поверхность скошенного агара в пробирке. Штрихи следует наносить со дна пробирки, не касаясь конденсата. При этом отсевают только те колонии, в которых бактерии по морфо-тинкториальным свойствам соответствуют бактериям, выявленным при микроскопии исследуемого материала. Появление колоний других бактерий свидетельствует о контаминации (загрязнении) посева посторонней микрофлорой.

Пробирки с посевами подпишите, указав дату, и поместите в термостат при 37⁰С на 18-24 часа.

П.Проведение П этап бактериологического метода выделения анаэробов.

Материал для посева – почвенная болтушка, в которой предполагается наличие спорообразующих микроорганизмов (клостридии газовой гангрены, столбняка, ботулизма). Для их выделения почвенная болтушка предварительно прогревается на водяной бане при 80⁰ в течение 20 минут для уничтожения вегетативных форм посторонней микрофлоры.

Почвенную болтушку наберите в стерильную пастеровскую пипетку до половины ее длины и, погрузив в пробирку со средой для контроля стерильности, вылейте самотеком засеваемый материал. Пипетку с оставшимся материалом опустите в дез.раствор.

Пробирки с посевами подпишите, указав дату, и поместите в термостат при 37⁰ на 24-48 часов.

Ш.Приборы, среды и методы для культивирования анаэробов:

3.1.Знакомство с приборами для культивирования анаэробов.

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабженный манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притертой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

3.2. Знакомство с методами культивирования анаэробов.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с 1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10%-м растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчетом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 37⁰С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Виньяль-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до

40-45 ⁰С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. Содержимое пробирки набирают в пастеровскую пипетку. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлей и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К₂СО₃ и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счет образующегося конденсата и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О₂ и выделением СО₂.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород.

Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 37⁰.

3.3. Знакомство со средами для культивирования анаэробов.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45⁰ полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na₂CO_3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Заполните дома таблицу №1 «Культивирование анаэробов»

Таблица 1

№ пп	Способ культивирования	Сущность способа	Используемые
приборы	методы	среды
1.	Физический
2.	Химический
3.	Биологический
4.	Комбинированный

Вопросы для самоконтроля:

1. Обоснуйте необходимость получения изолированных колоний для выделения чистой культуры микроорганизмов.

2. Какие признаки колоний изучают макроскопически в проходящем и отраженном свете, а какие - микроскопически (x 8)?

3. Обоснуйте необходимость посева исследуемого материала на среды накопления.

4. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов.

5. Физический способ создания анаэробных условий: суть, применяемый прибор.

6. Химический способ создания анаэробных условий: суть, применяемые прибор и методы.

7. Биологический способ создания анаэробных условий: суть, применяемый метод.

8. Комбинированный способ создания анаэробных условий: суть, применяемые методы и среды.

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 26-29, 46-67.

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 40, 41-42, 54-73.

Лекции по микробиологии.

Тесты.