Самостійна робота студентів. 1. Підготувати листок хроматографічного паперу для хроматографії (відмітити лінію старту та точки 1
1. Підготувати листок хроматографічного паперу для хроматографії (відмітити лінію старту та точки 1, 2, 3, 4).
2. Нанести 1, 2, 3, 4 об¢єми 0,01 М розчину амінокислоти, причому кожну наступну порцію розчину наносять після повного висушування паперу. Занурити хроматограму на кілька секунд у кювету з 0,5%-м розчином нінгідрину в ацетоні.
3. Просушити хроматограму при кімнатній температурі та прогріти протягом 15 хв. для проявлення забарвлення в сушильній шафі при 600 С.
5. Зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот вирізають, подрібнюють та вміщують в окремі пробірки №1, №2, №3 та №4.
6. Збоку на чистому місці вирізати рівний за розміром кружок з бумаги, що буде слугувати контролем і також подрібнюють та вміщують в пробірку №5.
7. Елюювати комплексну сполуку амінокислоти з паперу в розчин.
8. Витримати пробірки протягом 30 хв. в темному місці при кімнатній температурі.
9. Фотометрувати проти контрольної проби на ФЕК при 540 нм (зелений), кювета 5 мм.
10. На основі знайденої оптичної густини взятих концентрації побудувати
калібрувальний графік, для чого на осі абсцис відкладають концентрацію амінокислот в мікромолях, а на осі ординат – оптичну густину.
11. Знайти оптичну густину амінокислоти невідомої концентрації та за
калібрувальним графіком визначити її концентрацію.
12.Написати висновок.
Реактиви
1. Стандартні 0,01 М розчини амінокислот (кількість кожної амінокислоти, що відповідає 0,01 М розчину, зважують на аналітичних терезах і розчиняють в 0,01 н розчині соляної кислоти).
2. 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні (95 частин 0,5%-го розчину нінгідрину в ацетоні, 1 частина льодяної оцтової кислоти і 4 частини води змішують безпосередньо перед визначенням).
3. 0,005%-й розчин CuSO4×5H2O в 75%-му етиловому спирті (5 мг сульфату міді розчиняють в 22 мл води і об¢єм доводять 96%-м спиртом до 100 мл).
4. 96%-й етиловий спирт.
Матеріали та обладнання
Хроматографічний папір, дозатори з наконечниками, кювета з розчином нінгидрину в ацетоні, пробірки скляні зі штативом, витяжна шафа, термостат з t = 600 С, термостат з кімнатною температурою, ФЕК з довжиною хвилі 540 нм (зелений світлофільтр), кювети 5 мм, лінійка, олівець, ножиці.
Хід роботи
Студенти розділяють на бригади по 4 особи, проводять попереднє тренування в нанесенні води на звичайний папір за допомогою шприца. Олівцем підписують пластинку (прізвище або № бригади).
На листку хроматографічного паперу олівцем проводять лінію та відмічають 4 точки для нанесення розчинів амінокислот відомої концентрації та 4-ту точку розчину амінокислоти невідомої концентрації.
| лінія х х х х страту 1 2 3 4 |
Нанесення точок на хроматографічний папір
Шприцем наносять на 1-шу точку 5 мкл, на 2-гу точку - 10 мкл, на 3-тю – 20 мкл 0,001 М розчину амінокислоти або 0,05; 0,1; 0,2 мкмоль амінокислоти. На 4-ту точку наносять один об'єм амінокислоти невідомої концентрації.
Розчини на кожну наступну точку наносять після повного висушування попередньої точки. Після нанесення амінокислот на всі точки хроматографічний папір висушують на повітрі і занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м р-ном нінгідрину в ацетоні, просушують у витяжній шафі при кімнатній температурі і 15 хв прогрівають у термостаті при 60°С для проявлення забарвлення.
Зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот вирізають. Збоку хроматографічного листка паперу на чистому місці вирізають кружок паперу (контрольна зона для порівняння), що дорівнює за площею дослідним. Вирізані зони паперу подрібнюють ножицями і поміщують в 5 окремих пробірок, які підписують згідно з номером точки та контрольної зони. В кожну пробірку додають 5 мл 0,005%-го розчину сульфату міді в 75%-му етиловому спирті. Лілове забарвлення амінокислот переходить в оранжево-червоне внаслідок утворення Cu-похідного ДІДА і відбувається екстракція комплексної сполуки амінок-ти з паперу в розчин.
Для повної екстракції пробірки на 30 хвилин ставлять у темне місце при кімнатній температурі. Потім проби фотометрують проти контролю (пробірка з розчином контрольної зони) на ФЕК з зеленим світлофільтром (довжина хвилі 540 нм), кювета 5 мм. На основі знайденої оптичної густини та концентрації амінокислоти, що відповідає цій оптичній густині будують калібрувальний графік, де на осі абсцис позначають концентрацію амінокислоти у мікромолях (А), мкмоль), а на осі ординат – оптичну густину (D). За знайденою оптичною густиною амінокислоти невідомої концентрації (точка 4) визначають її концентрацію.
Висновок
ЛІТЕРАТУРА
1. Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з курсу «Хімія біологічно активних речовин», С. 3-9.
2. Биохимия./ Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев и др.- К.: Выща школа, 1988.- С.78-107, 295 – 340.
3. Основы аналитической химии./ Ю.А.Золотов, Е.Н.Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А.Золотова.- М.: Высшая школа, 2000.
4. Инструментальные методы химического анализа./ Г.Юинг.- М.: Мир,1989.