К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 31
(для студентов)
Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический Курс: 2
1. Тема занятия: Биохимия печени и метаболизм ксенобиотиков.
2. Учебная цель занятия: Изучить особенности метаболизма печени в норме и при патологии, оценивая ее функциональное состояние с помощью биохимических показателей крови и мочи.
3. Задачи занятия:
1. Используя вопросы для самоподготовки, основную и дополнительную литературу изучить теоретический материал по биохимии печени и метаболизму ксенобиотиков.
2. Ознакомиться с основными печеночными нагрузками и биохимическими показателями, характеризующими функциональное состояние печени.
3. Изучить основные механизмы обезвреживания в печени эндогенных продуктов обмена и ксенобиотиков.
4. Приобрести практические навыки определения концентраций общего конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови. Научиться использовать результата лабораторных биохимических исследований при диагностике патологических процессов (в печени) и оценивать их степень тяжести и динамику развития с помощью тимоловой пробы.
4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.
5. Задание студентам:
1. По цифровым значениям тимоловой пробы, полученным при исследовании двух образцов сыворотки крови, оценить функциональное состояние печени пациентов и поставить предположительный лабораторный диагноз.
2. Определить: концентрации общего, свободного и связанного билирубина в сыворотке крови, указать диагностическое значение определения этих показателей и поставить предположительный лабораторный диагноз.
3. Написать формулы прямого и непрямого билирубина.
4. Оформить результата лабораторных исследований в виде таблиц.
5. Выполнить тест-контроль по теме биохимия печени и метаболизм ксенобиотиковов.
Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.
Работа № 1. Тимоловая проба (диспротеинемический тест) и ее клинико-диагностическое значение.
Клинико-диагностическое значение: Тимоловая проба (ТП) - является одной из наиболее чувствительных осадочных проб и фиксирует дис- и парапротеинемию по изменению соотношения альбуминов и β, γ- глобулинов, липопротеидов, фосфолипидов и по появлению в сыворотке крови высокомолекулярных аномальных белков. Проба не специфична, так как дает положительный (+) ответ при острых и хронических воспалительных процессах протекающих в различных органах и тканях (печень, почки, легкие, соединительная ткань и т.д.).
ТП имеет цифровое выражение - от 0 до 20 и более ед. S-H, по которому можно судить о наличии патологического процесса и его и его степени тяжести и динамика развития. В норме (отсутствие воспаления) - ТП отрицательная –ТП (-), равна на 0-4 ед. S-Н, ТП (+) - при 5 -20 и более ед. S-Н.
В клинике ТП используется наряду с другими биохимическими тестами при диагностике заболеваний печени: ТП (+) - при острых вирусных и хронических токсических гепатитах, декомпенсированном циррозе, раке и его метастазах в печень. ТП (+) при печеночной желтухе. ТП (-) при надпеченочной и подпеченочной желтухе (без цитолиза).
Принцип метода: При взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером (рН=7,55) появляется помутнение вследствие образования глобулин-холестерин-липопротеид-тимол-фосфолипидного комплекса. Его интенсивность связана с количеством и % соотношением отдельных фракций. Степень помутнения оценивается нефелометрически на ФЭК.
Ход работы: Приготовить в пробирках растворы: Таблица 1
| № пробирки | Пробирки (мл) | |||
| Тимолово-вероналовый буфер | Н2О дист. | Сыворотка 1 | Сыворотка 2 | |
| «0» (контроль) | 0,1 | - | - | |
| - | 0,1 | - | ||
| - | - | 0,1 |
Содержимое пробирок перемешать и выдержать 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность Е1 и Е2 растворов измерить против "0" - (контрольная проба) на ФЭКе при длине волны 660 нм (красный светофильтр). Цифровые значения ТП (в условных ед. S-Н) вычисляло по формулам:
ТП1 = Е1 · 40,5, ТП2 = Е2 · 40,5, где Е1 и Е2 – оптические плотности сывороток 1 и 2; 40,5 – переводной коэффициент в ед. S-Н.
Он рассчитывается по формуле: [С]/Ест = 40,5, где [С] – концентрация раствора сравнения (48 ммоль/л BaCl2); Ест – оптическая плотность раствора BaCl2 против воды.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
Результаты работы оформить в виде таблицы:
Таблица 2
| № пробы | Е (оптическая плотность) | Цифровое значение ТП (в ед. S-H) | «+» или «-» | Вывод (предположительный лаб. диагноз): |
| Е1= | ТП1= | |||
| Е2= | ТП2= |
Работа № 2. Определение концентрации общего билирубина и его фракций (неконъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови по Йендрашику.
Клинико-диагностическое значение: Определение общего билирубина и его фракций (некоъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови и уробилиногена в моче относится к обязательным биохимическим исследованиям при диагностике заболеваний печени, так как позволяет установить уровень нарушения пигментного обмена и дифференциально диагностировать желтухи.
Содержание общего билирубина (БРобщ) в сыворотке крови в норме составляет 8,5-20,5 мкмоль/л (0,5-1,2 мг%), из них 75% приходится на долю свободного (неконъюгированного) билирубина (БРнекон).
Гипербилирубинемия (повышение концентрации БР в сыворотке крови) - является результатом нарушения динамического равновесия между скоростью образования и выделения БР и может быть вызвана различными причинами (гемолиз, цитолиз, холеотаз).
Повышение концентрации БР в сыворотке крови до 28мкмоль/л и более сопровождается желтушной окраской кожных покровов, слизистых оболочек склер глаз т.е. желтухой (за счет отложения в тканях диффундирующего из крови БР).
Принцип метода: Общий билирубин сыворотки крови (БРнекон. и БРкон.) определяется на основе реакции с диазореактивом (диазотированной сульфаниловой кислотой) после диссоциации комплекса альбуминов плазмы и БРнекон, в присутствии кофеинового реактива и перехода БРнекон в растворимое состояние. БРкон (растворимый) дает с диазореактивом розовое окрашивание сразу (без кофеинового реагента).
Интенсивность окрашивания исследуемого раствора пропорциональна концентрации азобилирубина в сыворотке крови и оценивается колориметриметрически на ФЭКе.
Концентрация БРнекон определяется расчетным путем как разность между концентрациями БРобщ и БРкон.
Ход работы: Приготовить в пробирках растворы:
Таблица 3
| № | Реактивы (мл) | № пробирки и определяемое вещество | ||
| 1. БРобщ | 2. БРкон | 3. Контроль | ||
| Сыворотка крови | ||||
| Кофеиновый реактив | 3,5 | - | 3,5 | |
| Физ. раствор | - | 3,5 | 0,5 | |
| Диазореактив | 10 капель | 10 капель | - |
Содержимое пробирок перемешать, пробирку № 2 (БРкон) выдержать 5 минут, а пробирку № 1 (БРобщ) - 20 минут при комнатной температуре. Затем замеряют оптическую плотность этих растворов (Е1 и Е2) против контрольной пробы (пробирка №3) на ФЭКе при длине волны 560 нм (зеленый светофильтр). Е - оптическую плотность стандартного раствора билирубина (концентрация БРобщ = 2 мг%) фотоколориметрируют против воды.
Концентрацию БРобщ в сыворотке крови (СБРобщ) вычисляют по формуле:
СБРобщ = Е1/Ест · 2 мг%, где 2 - концентрация БРобщ в стандартном растворе.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
Результаты работы оформить в виде таблицы:
Таблица 4
| Оптическая плотность Е | Е1 | Е2 | Ест | |
| Концентрация БР в сыв. крови | [БРобщ] | [БРкон] | [БРнекон] |
Концентрация БРнекон рассчитывается по формуле: БРнекон = БРобщ - БРкон
Вывод: предположительный лабораторный диагноз.
Работа №3: Решение ситуационных задач (см. приложение).
7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).
8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).
9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2011 г.
10. Учебное задание подготовлено поч. Ванчуговой Н.Н.
ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кафедра биохимии
Утверждаю
Зав. каф. проф., д.м.н.
Мещанинов В.Н.
_____‘’_____________2011 г
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 32/1
(для студентов)
Факультеты: лечебно-профилактический
Курс: 2
1. Тема занятия: Особенности метаболизма при старении
2. Учебная цель занятия: Изучить изменение обмена веществ в организме при старении
3. Задачи занятия:
1. Изучить теоретический материал о причинах, механизмах старения, изменении важнейших видов обмена веществ и их интеграции при старении.
2. Изучить теоретический материал по особенностям возрастзависимого изменения важнейших лабораторных биохимических показателей периферической крови.
3. Исследовать в ходе выполнения лабораторной работы изменения концентрации об. холестерина (об. белка) в пробах периферической крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста.
4. Рассмотреть результаты готовых данных исследования перекисного окисления липидов периферической крови людей разного биологического и паспортного возраста, сделать выводы о степени влияния биохимических изменений на темп старения (ситуационные задачи).
5. Обобщить теоретический материал, данные лабораторной работы и ситуационных задач, сделав выводы об изменении обмена веществ и возможности его коррекции при старении, особенностях биохимической диагностики в геронтологии.
4.Продолжительность занятия: 3 акад. часа.
5. Задание студентам:
1. Исследовать концентрацию холестерина (общ. белка) в периферической крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста ( работа № 1 и № 2).
2. Изучить лабораторные данные биохимических исследований людей разного биологического и паспортного возраста (см. приложение СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ), сделать заключение о вкладе уровня перекисного окисления липидов в процесс старения организма, наметить пути коррекции.
6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.
Работа № 1 Исследование концентрации холестерина в периферической крови у людей разного возраста.
Принцип метода. При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющиеся в пробе холестерин окисляются кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход работы: В пробирках готовят следующие растворы (табл. №1):
Таблица 1
Состав пробирок для определения холестерина
| Компоненты проб | № пробирки | ||
| 1 (А1) | 2 (А2) | 3 (В) | |
| Сыв-ка крови человека зрелого возраста | 0,02 мл | - | - |
| Сыв–ка крови человека пожилого возраста | 0,02 мл | ||
| Стандартный р-р холестерина | - | - | 0,02 мл |
| Реагент | 2,0 мл | 2,0 мл | 2,0 мл |
Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают 15 минут при температуре 20 градусов (комнатной температуре). Оптическую плотность всех растворов измеряют при зеленом светофильтре ФЭКа ( длина волны 490 нм. ), “ноль” устанавливают по воздуху.
Концентрацию холестерина в сыв-ке крови вычисляют по формуле:
Схс = ЕА1, А2/ ЕВ * 5,17 ( ммоль/л ) или СХС = ЕА1,А2 /ЕВ * 200 ( мг/100 мл ), где
Схс - концентрация холестерина в сыворотке крови, равная 2 м Моль/л
ЕА1, ЕА2 – оптическая плотность опытных растворов, ЕВ - оптическая плотность стандартного раствора.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
Оформить результаты работы в виде таблицы 2:
Таблица 2
Результаты исследования концентрации холестерина в сыворотке крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста
| № пробирки | |||
| Оптическая плотность | |||
| Значение концентрации холестерина ( мМоль/ л) |
В выводе сравнить между собой, а также с возрастными нормами из литературных источников, численные значения концентрации холестерина в сыворотке крови людей зрелого и пожилого возраста, объяснить обнаруженные различия исходя из возрастных особенностей метаболизма этого вещества и его регуляции.