Ориентировочная основа деятельности студентов (ООД) для проведения лабораторной работы: Ферментативная активность каталазы
Принцип метода. Каталаза- это фермент, который встречается в организме животных и человека преимущественно в печени и эритроцитах. Он разлагает перекись водорода (токсический побочный продукт клеточного дыхания) на воду и кислород.
2H2O2 каталаза 2H2O + O2
Подготовка эксперимента
1.Положить печень цыпленка в ступку, пестиком измельчить ткань печени до однородного состояния, постепенно добавить воду (общий объем воды 10 мл). Полученный экстракт («печеночный сок») профильтровать через сито.
2. 1 мл полученного « печеночного сока» налить в пенициллиновый флакон и поместить в водяную баню на 5 минут.
3. 1 мл полученного « печеночного сока» налить в пенициллиновый флакон и поместить в поддон со льдом до проведения эксперимента.
Работа № 1 «Изучение ферментативной активности каталазы»
Порядок выполнения:
1. Налить 10 мл 3% H2O2 в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.
2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (рис.)
3. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть
колбу пробкой (предварительно смазанной глицерином).
4. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).
5. Включить магнитную мешалку.
6. Зарисовать в тетрадь полученный график.
Наблюдения и результаты:
В колбе наблюдается отчетливое выделение пузырьков О2. Кривая
давления резко возрастает, но затем вертикально падает, из-за того,
что резиновую пробку выбило давлением с колбы.
Работа № 2 «Влияние щелочной среды на активность фермента»:
1. Налить 10 мл 3% H2O2 в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.
2. Добавить 10 мл 1 моль раствора NaOH.
3. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (рис.).
4. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой
( предварительно смазанной глицерином).
5. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).
6. Включить магнитную мешалку.
7. Зарисовать в тетрадь полученный график.
Наблюдения и результаты:
Визуально реакция протекает слабее. Кривая давления возрастает гораздо менее резко, чем при нормальных условиях, что говорит о снижении активности фермента при рН > 7.
Работа № 3 «Влияние кислой среды на активность фермента»
1. Налить 10 мл 3% H2O2 в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.
2. Добавить 10 мл 1 молярного раствора HCI.
3. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (рис.).
4. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой
( предварительно смазанной глицерином).
5. Немедленно начать измерения (время работы 60 сек).
6. Включить магнитную мешалку.
7. Зарисовать в тетрадь полученный график.
Наблюдения и результаты:
Выделение O2 не наблюдается, давление в колбе остается постоянным. Кривая давления не возрастает, что говорит об отсутствии активности каталазы при рН < 7.
Работа № 4 «Влияние высокой температуры на активность фермента»
1. Налить 10 мл 3% H2O2 в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.
2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (рис.).
3. Добавить 1 мл « печеночного сока», предварительно прогретого на водяной бане и немедленно закрыть колбу пробкой (смазанной глицерином).
4. Немедленно начать измерения (время работы 60 сек).
5. Включить магнитную мешалку.
6. Зарисовать в тетрадь полученный график.
Наблюдения и результаты:
Выделение O2 не наблюдается. Кривая давления не возрастает, что говорит о потере ферментативной активности при нагревании вследствие денатурации.
Работа № 5 «Влияние низкой температуры на активность фермента»:
1. Налить 10 мл 3% H2O2 в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.
2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (рис.).
3. Добавить 1 мл охлажденного « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой (смазанной глицерином).
4. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).
5. Включить магнитную мешалку.
6. Зарисовать в тетрадь полученный график.
Наблюдения и результаты:
В колбе наблюдается отчетливое выделение O2. Кривая давления резко возрастает, но затем вертикально падает из-за того, что резиновую пробку выбило давлением. Резкое охлаждение, в отличие от нагревания, дезактивирует каталазу лишь временно. При нагревании раствора до 37о активность фермента возрастает.
Клинико – диагностическое значение:
1. Каталаза является ферментом, простетическая группа которого идентична гему. В крови каталаза содержится почти исключительно в строме эритроцитов.
1) Активность фермента крови выражают каталазным числом (количество мг Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови). В норме каталазное число составляет 10 – 15 единиц. Определение активности каталазы имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях активность фермента снижается.
2) 3% раствор Н2О2 применяют в качестве дезинфицирующего и дезодорирующего средства для промываний и полосканий при воспалительных заболеваний слизистых оболочек (стоматиты, ангина), обработки ран и т.п.
2. Термолабильность ферментов учитывается в практической медицине в следующих случаях:
1) для рационализации терапевтических приемов при развитии воспалительного процесса, сопровождающегося изменением терморегуляции (повышение температуры тела при лихорадочных состояниях);
2) снижение интенсивности метаболических процессов путем гипотермии при выполнении тяжелых хирургических манипуляций с целью уменьшения осложнений (кардиохирургия).
3) Снижение активности ферментов при охлаждении позволяет сохранять жизнеспособность клеток, тканей, органов (кровь, почки и др.) для трансплантации (метод низкотемпературной консервации
3. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны рН.рН крови человека колеблется в пределах от 7,37 до 7,43; изменение этих значений всегда критично для витальных функций организма. Сдвиг рН в кислую сторону называется АЦИДОЗ, в щелочную – АЛКАЛОЗ. Развитие этих состояния требует немедленного оказания медицинской помощи.
Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время:
1. Объясните механизм влияния на метаболизм гипотермии, гипертермии.
2. Привести примеры лекарственных веществ, действующих по принципу ингибирования.
3. Почему необходимо срочно выводить больных из состояния ацидоза?
4. Что дает практической медицине изучение свойств и функций ферментов?
5. На чем основана низкотемпературная консервация органов и тканей, используемых в дальнейшем для трансплантации?