Ентген сәулесінің дифракциясы әдісі.

Жасушалар мен макромолекулалардың құрылысын оқып- зерттеуде рентгенді құрылымды талдау әдісінің мәні зор. Рентгенді құрылымды талдау зерттелетін затта электромагниттік сәулелердің дифракциясы құбылысына негізделген объектілер құрылымын анықтау әдісі.

Мембрана құрылымын анықтау кезінде рентген сәулесінің дифракциясының пайда болуының ең негізгі шарттарының бірі- объектіге бағытталған рентген сәулесінің толқын ұзындығы мен объектінің өлшемдері бірдей болуыболып табылады. Нанометрлі диапазондағы объектілерді талдау үшін рентген сәулесі қажет (оның толқын ұзындықтарының диапазоны 10 ^-5 - 80 нм- ге дейін).

Рентген сәулесінің жолында өлшемдері осы сәулелердің толқын ұзындығындай болатын бөгеттер болған кезде ғана дифракция байқалады.

Заттың құрылымын анықтауда рентген сәулесінің қолданылу принципін ұғыну үшін заттың кристалл торын қарастырайық. Ондағы көрші екі атомға параллель сәулелер түседі дейік (сурет 5). Осы рентген сәулелері кристалл тордың көрші атомдарынан шағылып, одан кейін интерференцияланып, экранның бір нүктесіне шоғырланады. Атомаралық қашықтықтың d, сырғанау бұрышының мәндерін енгізе отырып, сәулелер жолының айырмасын табамыз: ;

Сурет 5. Рентген сәулесінің дифракциясы.

Экранның қандайда бір нүктесінде екі толқынның бірін- бірі күшейтуінің шарты осы жол айырмасының толқын ұзындығының бүтін санына тең болатындығы болып табылады: .

Экрандағы дифракция суретін бақылай отырып, мысалы, бірінші ретті максимумның (n=1) қандай бұрышпен бақыланатынын анықтауға болады. Толқын ұзындығын біле отырып, зерттелетін зат құрылымының маңызды параметрін – атомаралық қашықтықты табуға болады: ;

Мембрананың құрылымын зерттегенде нақты зерттеу әдістемесі анағұрлым қиын, бірақ ол жоғарыда айтылғандарға негізделеді.

Рентгенді құрылымды талдаудың көмегімен

фосфолипидтердің биқабатты орналасатындығы және мембранада ақуыздардың бар екендігі дәлелденген, мембрананың маңызды параметрлері есептелінген.

юминесценттік әдіс.

Люминесценция-«суық жарқырау». Тірі табиғатта кең тараған люминесценция- биолюминесценция. Жарқырауды туғызатын факторларға байланысты люминесценция бірнеше түрге бөлінеді: фотолюминесценция, электролюминесценция, пьезолюминесценция, хемилюминесценция және т.б. Биологиялық объектілердің люминесценциясы меншікті (бірінші ретті) болуы мүмкін не зерттелетін жүйеге арнайы заттарды қосу есебінен (екінші ретті) пайда болуы мүмкін. Қарапайым ақуыздардың меншікті люминесценциясы (жарқырауы) триптофан мен тирозиннің амин қышқылдарының бар болуымен анықталады.

Меншікті люминесценциясы болмайтын көптеген қосылыстар сәйкес химиялық өңдеу кезінде люминесценциялана бастайды. Бұл екінші ретті люминесценция деп аталады. Оны ауруды диагностикалауда қолданады.

Биологиялық мембраналардың құрылымы, қызметтерін, ақуыздар мен нуклеин қышқылдарының макромолекулаларының құрылымдық орналасуын оқып- зерттеуде қосылыстардың флюоресцентті зондтар деп аталатын екінші ретті люминесценциясы кең түрде қолданылады. Осындай зондтар ретінде люминесценция параметрлері қоршаған ортаның сипаттамаларына (полярлығы, тұтқырлығы, беттік заряды т.б.) тәуелді күрт өзгеретін заттар таңдап алынады. Зондтар үш түрлі болады:

1) зарядталған;

2) зарядталмаған, бірақ біршама дипольдік моменті болатын;

3) заряды да, біршама дипольдік моменті де болмайтын.

Флюоресценттік зондтар ретінде суда жарқырамайтын, ал биологиялық мембраналармен не ақуыздармен әсерлескенде ондаған есе жарқырайтын молекулалар қолданылады. Медициналық техникада люминофорлар кең таралған. Люминофорлар дегеніміз жұтқан энергиясының нәтижесінде жарқырауға қабілетті заттар.

Флуоресценттік талдау мембранада фосфолипидтер молекулалардың қозғалғыштығын, мембрананың липидтік фазасының тұтқырлығын (микротұтқырлық) анықтауға мүмкіндік береді.

Мембрананың микротұтқырлығын флюоресценция спектрлерінің өзгерістері бойынша және мембрананы поляризацияланған жарықпен жарықтағанда флюресценттік сәулелердің поляризациялану дәрежесі бойынша бағалауға болады. Мембрананың поляризациялану дәрежесі мен микротұтқырлығының байланысы Перрен және Яблонский формуласымен өрнектеледі. Осы формуладан, люминесцентті сәулелер (мембрананың сырттан сәулеленуіне жауап ретінде пайда болған) неғұрлым нашар поляризацияланған болса, зерттелетін бөліктегі молекулалар соғұрлым қозғалғыш болады және сол жерде микротұтқырлық соғұрлым төмен болады. Керісінше, люминесцентті жарықтың поляризациялану дәрежесі неғұрлым жоғары болса, молекулалардың қозғалғыштығы соғұрлым төмен болып, ал микротұтқырлық соғұрлым жоғары болады.

льтрахимия әдісі.

Бұл әдіс жасушаның химиялық құрамын зерттеуде қолданылады. Осы әдіс жасушадан, оның жеке бөліктерінен және органоидтерден өте аз мөлшерде заттарды алуға негізделген. Кейіннен арнайы химиялық әдістермен алынған заттарды сапалық және мөлшерлік талдау жүргізіледі.

ты және ЭПР.

Липидтік биқабаттың агрегаттық күйі туралы толық мағлұматтарды радиоспектроскопияның ЭПР және ЯМР әдістері береді.

дролық магнитті резонанс (ЯМР) деп толқынның резонансты жиілігі кезінде сыртқы магнит өрісіне енгізілген, магнит моменттері бар атом ядролары жүйесінің электромагниттік толқындардың энергиясын жұтуының кенет арту құбылысын айтады.

Ядролық магнитті резонанс (ЯМР) дегеніміз тұрақты магнит өрісіндегі атом ядроларының магнит моменттері бағыттарының өзгеруімен айқындалатын, заттың электромагниттік сәулелерді таңдамалы жұтуы.

ЯМР әдісі кезінде тұрақты магнит өрісіне енгізілген заттың ядролары белгілі бір жиіліктегі сыртқы айнымалы электромагниттік сәулелену энергиясын таңдап (резонансты) жұтып, ЯМР сигналы пайда болады. Әртүрлі ядроларға резонанстың әртүрлі жиілігі сәйкес келеді. Осы жиіліктер аймағы электромагниттік толқындардың радиожиілікті диапазонында жатады, сол себепті ЯМР радиоспектроскопияның әдістерінің бірі болып табылады. Биожүйелерді зерттеу үшін сутегі ядроларының- протондардың (¹Н), дейтерийдің ( ²Н), көміртегі (¹³С), натрий ядорларының т.б. ЯМР қолданылады. Электрондық парамагниттік резонанс (ЭПР) – толқынның резонансты жиілігі кезінде сыртқы магнит өрісіне енгізілген парамагниттік бөлшектер жүйесінің (орны толтырылмаған спиндері бар электрондар) электромагниттік толқындардың энергиясын жұтуының кенет арту құбылысы. ЭПР- қа негізделген әдістер зертханалық тәжірибеде кең қолданылады. ЭПР радиоспектроскопия әдістеріне жатады, өйткені оны бақылау үшін

электромагниттік толқындардың радиожиілікті диапазонындағы сәулеленулер қолданылады. ЭПР арнайы құралдар – радиоспектрометрлер көмегімен тіркеледі.

ЭПР-ты қолдану ЭПР- тың спектрлерін зерттеумен анықталады. ЭПР спектрі деп электромагниттік толқынның жұтылу қуатының сыртқы өрістің магнит индукциясының шамасына тәуелділігін айтады. Үлгінің атомдары мен молекулалары арасындағы өзара әсер неғұрлым күшті болса, ЭПР спектрлері соғұрлым енді болады. Бөлшектер арасындағы өзара әсер неғұрлым әлсіз болса (молекулалардың қозғалғыштығы жоғары), ЭПР спектрі соғұрлым жіңішке болады. ЭПР спектрлерінің енділігіне қарап, заттардың молекулаларының қозғалғыштығы туралы пікір айтуға болады.

Фосфолипидтер молекулалары диамагниттік болғандықтан, мембрананы ЭПР- ты зерттеу үшін спин- зондтар және спин- белгілер- жұпсыз электрондары бар молекулалар немесе молекулалық топтар қолданылады.

Парамагниттік спин- зондтар липидтік мембранаға енгізіледі, электромагниттік толқындардың спин- зондтарының жұту спектрлері липидтер жөнінде ақпарат береді, әсіресе мембранадағы липидтік молекулалардың қозғалғыштығы жайында. Бұл әдістің айрықша кемшілігі бар – биологиялық объектіге тегі бөтен молекула- зондтарды енгізу объектінің құрылымын өзгертуі мүмкін. Осы кемшілік ЯМР әдісте болмайды.