Специальные методы обработки тканей.

1. Декальцинация.Применяется по отношению к плотным тканям (кость, зуб). Цель – извлечение солей извести. Вследствие этого объект становится мягким и пригодным к резке. Декальцинация всегда производится после фиксации. Объект помещают в 2-10% раствор азотной кислоты на несколько дней.

2. Импрегнация.Метод отложения солей тяжелых металлов на каких-либо структурах с целью их выявления. Применяют соли серебра, золота. Этот метод применяется для выявления нервных волокон, аргирофильных волокон (ретикулярных, преколлагеновых), клеточных границ, комплекса Гольджи.

3. Гистохимические методы исследованияпроводят с целью выявления содержания и локализации химических веществ, входящих в состав тканей, постановкой химической реакции непосредственно на срезе ткани. В результате реакции взаимодействия искомых групп или элементов исследуемого вещества с реактивом получается специфическое окрашивание. Пользуясь специальными реактивами, можно выявить аминокислотный состав белков, выявить наличие нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), определить наличие микроэлементов, ферментов и т. д.

Например: для выявления трехвалентного железа ткань обрабатывают свежеприготовленной равной смесью 2% ферроцианида калия (желтая кровяная соль) и 2% соляной кислотой.

Участки, в которых локализуется трехвалентное железо, окрашиваются в синий цвет (берлинская лазурь).

Гликозаминогликаны (ГАГ) дают реакцию метахромазии – изменение основного цвета красителя при взаимодействии его с искомым веществом. При окрашивании толуидиновой синью, тионином (красители синего цвета) ГАГ дают вишнево-красную окраску. ДНК выявляется реакцией Фельгена, РНК – реакцией Браше, углеводные соединения – ШИК-реакцией и т.д.

Цитохимия - сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии – позволяет изучать локализацию химических веществ на субклеточном и молекулярном уровнях.

4. Иммуноцитохимический(иммунофлюоресцентный) метод – основан на реакции антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав. Антитела обладают высокой специфичностью в отношении антигенов, что позволяет использовать их для выявления специфических белков. Антитела окрашивают флюоресцирующими красителями и после свзывания их с определенной структурой, препарат изучают в люминесцентном микроскопе.

Антитела можно использовать для изучения антигенных структур на ультрамикроскопическом уровне. Для этого антитела метят электронно-плотными частицами, например коллоидным золотом.

Авторадиография.

Меченые атомы широко используются в цитологии для изучения химических процессов в клетке. Например: для изучения биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, проницаемости оболочки, локализации веществ в клетке и т. д.

Для этого используются соединения, в которые введена радиоактивная метка. В молекуле меченого вещества, например, аминокислоты или углевода, один из атомов замещается атомом того же вещества, но радиоактивного, т. е. радиоактивным изотопом. Благодаря тому, что эти атомы ведут себя в организме также, как и не обладающие радиоактивностью, но при этом испускают радиоактивные лучи, их можно легко обнаружить, применяя фотографический метод.

В цитологии используются изотопы водорода – тритий 3Н, изотоп углерода – 14С, фосфора 32Р, серы 35S, йода и др., которые входят в состав органических соединений. Вводят изотопы в организм животных с пищей, в виде инъекций или же в питательную среду при культивировании тканей. Они включаются в обмен веществ. Доза устанавливается опытным путем и не должна изменять нормальный обмен веществ. Через разные промежутки времени после введения меченых веществ фиксируются кусочки тканей и органов (смесь Кариуа или спирт-уксусная кислота 3:1). Из фиксированного материала готовят парафиновые срезы, на поверхность которых после удаления парафина наносят тонкий слой чувствительной и фотографической эмульсии. Эта ядерная эмульсия характеризуется очень мелким размером зерен, их однородностью и гораздо большим насыщением желатина, чем обычная фотографическая эмульсия.

Препараты с нанесенной на них фотоэмульсией экспонируется в темноте при температуре 4 градуса, а потом промываются и закрепляются также, как и обычные фотографии.

Во время экспозиции препаратов изучение радиоактивных изотопов, которые включились в те или иные структуры клетки, оставляет след от пробега радиоакт. частиц в слое фотоэмульсии. В процессе проявления зерна, которые оказались в местах пробега радиоакт. частиц, восстанавливаются проявителем до металлического серебра. Последние имеют черный цвет и выявляются после проявления в виде зерен, которые находятся в слое фотоэмульсии над теми клетками и структурами, в которые включился радиоактивный изотоп. Такие препараты называют радиоактографами. После проявления и закрепления радиоактографы хорошо промывают в воде, а затем окрашивают одним из гистологических красителей.

Контрольные вопросы

1. Методы исследования, используемые в современной гистологии, цитологии и эмбриологии.

2. Витальные методы исследования. Культивирование in vivo и in vitro.

3. Основные принципы приготовления препаратов для световой микроскопии.

4. Этапы приготовления постоянного гистологического препарата.

5. Виды микропрепаратов.

6. Общая характеристика и классификация гистологических красителей.

7. Гистохимические методы исследования.

8. Сущность метода импрегнации, декальцинирования, авторадиографии.

Вопросы, вынесенные на СРС

1. Основные принципы приготовления препаратов для электронной микроскопии.

2. Количественные методы исследования.