Использование маркеров антибиотикоустойчивости: за и против

Значительная часть штаммов пробиотиков чувствительна к большинству антибиотиков. Данные литературы [12] свидетельствуют о том, что, в большинстве случаев, Lactobacіllі, Enterococcі, Bacіllus cereus и Bіfіdobacterіa не являются резистентными к таким повсеместно используемым антибиотикам, как амоксициллин, доксициклин, фторхинолоны и цефалоспорины.

Это существенный недостаток бактериальных препаратов, который заметно ограничивает их использование, ведь их применение наряду с антибиотикотерапией или непосредственно после нее неизбежно сопровождается инактивацией штаммов таких пробиотиков. Поэтому было предложено использовать антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов-про-биотиков.

Полирезистентные пробиотические культуры могут применяться одновременно с антибиотиками для профилактики возникновения побочных явлений со стороны пищеварительного тракта, вызванных пероральными антибиотиками, а также для уменьшения экономического ущерба, связанного с невозможностью использовать для производства ферментированных молочных продуктов, молоко, содержащее следы антибиотиков [498]. Сгусток в молоке не образуется, если количество антибиотиков в нем превышает 0,2 ЕД эритромицина, 0,2 ЕД пенициллина, 1 ЕД хлортетрациклина и тетрациклина, 2 ЕД мономицина, 2 ЕД левомицетина, 2 ЕД стрепромицина [498].

Для получения штаммов с множественной устойчивостью изучалась перекрестная резистентность с последующим отбором клонов-мутантов, устойчивых к комплексному воздействию антибиотиков. Другие исследователи индуцировали подобные мутации с последующим отбором или с помощью генной инженерии, размещали ген антибиотикоустойчивости на плазмиде-векторе. Последний подход имеет сущетвенный недостаток, заключающийся в том, что существует риск плазмидной передачи патогенам резистентности к антибиотикам [565].

С ростом применения методов рекомбинации и генной инженерии для селекции производственно-ценных штаммов пробиотиков увеличивает вероятность их антибиотикоустойчивости. Так, недавно при изучении 187 культур, выделенных из разных йогуртов, производимых в 8 странах Европейского Союза, была найдена устойчивость к канамицину у 79% изолятов, к ванкомицину – у 65, к тетрациклину – у 26, пенициллину – у 23, эритромицину – у 16 и хлорамфениколу – у 11%. При этом большая часть культур (68,4%) характеризовалась множественной медикаментозной устойчивостью [694].

Было продемонстрировано перенесение плазмид из Lactobacіllus reuterі на Enterococcus faecіum, а также с E.faecіum на E.faecalіs в процессе приготовления мясомолочной продукции. Инфицирование E.faecіum представляет серьезную опасность, потому что у многих штаммов этой бактерии есть плазмиды, которые кодируют резистентность к разнообразным антибиотикам, включая ванкомицин [565.]. Эти находки настораживают и требуют контроля над культурами стартеров молочнокислых бактерий, используемых для производства продуктов питания, в плане отсутствия мобильных генетических элементов, которые включают гены антибиотикорезистентности. Из-за опасности существования резистентности энтерококков к ванкомицину, которая может передаваться другим мультирезистентным бактериям, использование этого антибиотика рекомендуется ограничить [559, 653].

«Искусственная», или приобретенная, резистентность к антибиотикам может возникать в результате действия двух разных механизмов: мутаций в конституциональных генах (генах «домашнего хозяйства» – housekeeping genes; в этом случае передача гена резистентности теоретически происходить не может), а также приобретения экзогенных детерминант резистентности от других микроорганизмов путем упомянутого уже горизонтального перенесения плазмид антибиотикорезистентности [554, 558]. В таком случае возможна дальнейшая передача гена резистентности от пробиотика к микроорганизмам, патогенным для человека как непосредственно, так и опосредованно, через сапрофитную микрофлору. Такое явление получило название генетического загрязнения детерминантами резистентности [522].

Считают, что возможность распространения генов резистентности достаточно высока только в случае перенесения мобильного генетического элемента (плазмиды или транспозона) и почти отсутствует, если ген резистентности является хромосомным. Однако некоторые хромосомные гены все же успешно переносятся in vivo [633, 555].

Таким образом, использование генетически модифицированных микроорганизмов (ГММО), их интродукция в окружающую среду, в том числе в составе пробиотических заквасок, должно быть крайне осторожным. Наиболее уязвимым звеном экосистемы при интродукции в нее ГММО считаются возможное качественное видоизменение микробной ассоциации из-за неконтролируемой передачи гетерологичной генетической информации от ГММО к патогенным микроорганизмам. Селекция микроорганизмов, которые можно использовать как пробиотики, является продолжительным и сложным процессом. Состав пробиотика, прежде всего, должен быть безопасным. Микроорганизм не может быть патогенным, и особое внимание нужно обращать на возможность развития инфекции у иммунодефицитных лиц. Нежелательно, чтобы культура, которая входит в состав пробиотического БП или ПФП, содержала плазмиды антибиотикорезистентности, поскольку гены, ответственные за эту особенность, могут быть переданы патогенным микробам в организме пациента. Вместе с тем микроорганизмы должны быть устойчивыми к действию антибиотиков, кислоты и желчи, чтобы достичь предполагаемой зоны колонизации.

Резистентность пробиотических микроорганизмов к антибиотикам была изучена Артюховой с соавт. [15]. Ряд антибиотиков подобран, как наиболее часто успешно применяемых для лечения различных заболеваний в России: бензилпенициллин, ампициллин, эритромицин, гентамицин, левомицетин, стрептомицин, оксациллин, линкомицин, тетрациклин. Результаты исследований представлены в табл. 2.1 [15].

Таблица 2.1 – Изучение резистентности микробных консорциумов к антибиотикам

Наименование антибиотика	Ед. измерения активности антибиотика	Терап. конц.	Изучаемые дозы антибиотиков	Концентрация антибиотика, к которой устойчивы консорциумы пробиотиков
1*
Бензилпенициллин	Ед/см3		100 тыс.; 10 тыс.; 1000, 500, 100	10 тыс	100 тыс	100 тыс
Ампициллин	мкг/см3		500; 50; 25; 5; 2,5
Эритромицин	мкг/см3		2000; 200; 20; 2; 1
Гентамицин	мкг/см3		80; 40; 8; 4; 0,8
Левомицетин	мкг/см3		2500; 250; 25; 2,5; 1,25
Стрептомицин	мкг/см3		10тыс.; 1000; 100; 10; 1			10тыс
Тетрациклин	мкг/см3		1000; 100; 10; 1; 0,1
Оксациллин	мкг/см3	Нет данных	5; 0,5; 0,05; 0,025; 0,0025
Линкомицин	мкг/см3	0,03	0,03; 0,003; 0,0003	0,03	0,03	0,03

*Примечания:

1 – Streptococcus salvarius subsp. thermophilus и болгарской палочки Lactobacillus delbrukii subsp. Bulgaricus.

2 – Propionibacterium freudenreichii (подвиды shermanii, globosum).

3 – Streptococcus salvarius subsp. thermophilus и болгарской палочки Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus Propionibacterium freudenreichii (подвиды shermanii, globosum).

Данные, представленные в табл. 2.1, свидетельствуют, что ассоциаты, (за исключением 2 – к эритромицину) проявляют устойчивость к терапевтическим концентрациям исследуемых антибиотиков. Маркировка микроорганизма антибиотиками – классическое условие проведения с ними генетических манипуляций и анализа последних. С этой целью мы отбирали спонтанно образующиеся мутанты антибиотикоустойчивых клонов лактококков, культивируя культуры в гидролизованных молочных средах, содержащих в мкг/см³: 1÷100 Cm, 10÷2500 Sm, 0,5÷15 Ар, 1÷100 Тс, 1÷1000 Кm, 1÷30- Пn, 1÷20 Gm. Провели 12–20 пассажей с постепенным увеличением содержания антибиотика. После каждой ингкубации в течение 48 час на плотной среде (посев истощающимся штрихом), или 12 час на жидкой, культуру переносили на среду, содержащую более высокую концентрацию антибиотика, значение повышения, содержания которого определялось практическим путем индивидуального для каждой культуры и антибиотика. Удалось выделить культуры лактококков, устойчивые к следующим предельным конентрациям в мкг/см³:100 Cm, 2500 Sm, 10 Ар, 70 Тс, 1000 Кm, 25 Пn, 16 Gm.

Параллельно, через 3-4 пассажа с антибиотиком проверяли сохранение антибиотирезистентными мутантами лактосбраживающей способности культивированием в 10%-ном восстановленном молоке и активность сквашивания, определяемую без присутствия антибиотика через 8 часов инокуляции 5% культуры. Результаты исследований, наиболее показательных и интересных в отношении применения в качестве маркированных в генетических экспериментах штаммов, приведены в табл. 2.2.

Как видно из результатов исследований, не все спонтанные мутанты по более высокой антибиотикорезистентости сохраняли способность сбраживать молоко. В генетических экспериментах мы использовали маркеры антибиотикоустойчивости лактококков (до, в 100 мг/ см³⁾ к стрептомицину –2000, тетрациклину – 70 и хлоромфениколу – 50^. [359]. Для лактоккков антибиотикоустойчивость была естественно селекционируемой, что является гарантом того, что она не является признаком ГММО с неконтролируемой передачей гетерологичной генетической информации.

В отличие от естественной, индуцированной селекций и конъюгации между близкородственными видами микроорганизмов, использование в генетических рекомбинациях мобилизующих конъюгативных бирепликонных плазмид с широким кругом хозяев, как и получение рекомбинантов путем слияния протопластов, что отмечалось выше, ограничивает широкое практическое применение полученных рекомбинантов в составе БП и ПФП по причине возможности дальнейшей передачи гена резистентности антибиотику от пробиотика к микроорганизмам, патогенным для человека.

Таблица 2.2 – Влияние резистентности к антибиотику на кислотообразующую активность лактококков