Вывод о влиянии времени инкубации и pH среды на активность фермента

Контрольные вопросы:

1. Какие важные сведения вытекают из результатов опыта по исследованию активности ферментов при различных значениях рН среды?

2. Обьясните необходимость проведения опытов по изучению активности ферментов при различых временных интервалах?

3. Сформулируйте принцип метода определения активности фермента гли-гли-дипептидазы.

Лабораторная работа №7

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ВИТАМИНЫ

Опыт 1. Качественная реакция на тиамин (реакция

окисления тиамина в тиохром)

К 2-3 мг тиаминхлорида в пробирке добавляют 5-10 капель 5%-ного раствора гексациано-(III)-феррата калия и 2 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия, тщательно перемешивают. При нагревании жидкость окрашивается в жёлтый цвет вследствие превращения тиамина в тиохром. Затем в пробирку вносят 1 мл изобутилового спирта и интенсивно взбалтывают в течение 1 минуты. Наблюдают голубую флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах.

Опыт 2. Качественная реакция на витамин В2

К 0,5 мл раствора рибофлавина добавляют 10 капель концентрированной соляной кислоты и небольшой кусочек металлического цинка. Жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается. Смена окраски обусловлена восстановлением рибофлавина выделяющимся водородом сначала в рибофлавин красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.

Опыт 3. Качественные реакции на витамин С

Качественные реакции на витамин С основаны на его способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и легко восстанавливать различные реагенты.

1. Взаимодействие с метиленовой синью

К 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют равное количество 0,01% раствора метиленовой сини, перемешивают и закрывают пробкой для предохранения от соприкосновения с кислородом воздуха. Пробирку помещают в термостат при 37-40°С. Наблюдают постепенное обесцвечивание раствора. Если после обесцвечивания раствор энергично встряхнуть, не препятствуя доступу воздуха в пробирку, то раствор вновь приобретёт окраску.

2. Реакция с гексациано-(II) ферратом калия

К 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 2 капли раствора гидроксида калия. 2 капли раствора гексациано-(III) феррата калия и энергично встряхивают содержимое пробирки. Затем в пробирку добавляют 6-8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1-2 капли раствора хлорида железа (III). Наблюдают выпадение синего (зеленовато-синего) осадка берлинской лазури.

3. Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом

К 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 1 мл 0,02%-ного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, перемешивают и наблюдают обесцвечивание раствора.

Опыт 4. Качественная реакция на витамин РР

К небольшому количеству витамина РР добавляют 10-20 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до растворения витамина. К горячему раствору прибавляют равный объём 5%-ного раствора ацетата меди. При стоянии выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.

Содержание отчёта

Полученные результаты заносят в таблицу:

Витамин	Реактив	Наблюдаемый эффект

Контрольные вопросы

1. Напишите уравнение реакции восстановления рибофлавина в лейкофлавин.

2. Напишите уравнение реакции перехода L-аскорбиновой кислоты в L-дегидроаскорбиновую кислоту.

3. Напишите уравнение реакции окисления аскорбиновой кислоты гексациано-(II) ферратом калия.

Уравнения реакций:

Лабораторная работа №8

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ МЕТОДОМ СПИРИНА

Метод основан на измерении оптической плотности перхлорного экстракта ткани. Экстракцию суммарной фракции нуклеиновых кислот осуществляют 0,5 и перхлорной кислотой в течении 20 минут при нагревании на кипящей водяной бане. При этом нуклеиновые кислоты гидролизуются до растворимых компонентов, тогда как белки остаются в осадке и не мешают определению.

Реактивы и оборудование

─ 0,5 и раствор перхлорной кислоты.

─ Спектрофотометр, центрифуга, центрифужные пробирки, водяная баня, пипетки, пробирки.

Ход работы

50 мг ткани помещают в центрифужную пробирку, приливают 5 мл 0,5 и раствора HCIO4. Содержимое пробирки нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, затем охлаждают и центрифугируют. Измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости при 270 и 290 нм в кюветах толщиной 1 см против контроля (0,5 и HCIO4). Расчёт концентрации нуклеиновых кислот ведут по формуле:

с = 54,21 * (D270 - D290), с – концентрация нуклеиновых кислот в гидролизате, мкг/мл, D270 – оптическая плотность при 270 нм, D290 – оптическая плотность при 290 нм, 54,21 – пересчётный коэффициент.

Расчёт содержания нуклеиновых кислот в 1 мг ткани ведут по формуле:

С = с * 5/50 (мг нуклеиновой кислоты на 1 мг ткани).

Полученные результаты заносят в таблицу: