Определение активности фермента
Активность ферментов определяют:
- по скорости убывания субстрата;
- по скорости образования продукта.
За единицу активности любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества в 1 минуту.
мкмоль
Удельная активность = -----------------------
мин .мг белка
Изоферменты
Это разновидности ферментов, катализирующие одну реакцию, но отличающиеся по своему составу и физико-химическим свойствам.
Изоферменты имеются у ферментов с четвертичной структурой. Изоферменты различаются по кинетическим параметрам (Vмакс и Км), тканевой локали-зации, электрофоретической подвижности, чувствительности к регуляторам и т.д.
В зависимости от возраста, физиологического состояния и других причин, в организме устанавливается определенное соотношение изоферментов, которому соответствует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение их соотношения в отдельных тканях или органах является одним из способов регуляции метаболических процессов в организме.
Определение в сыворотке крови активности определенных изоферментов используется для диагностики.
Регуляция активности ферментов
Вещества, изменяющие активность ферментов, называются эффекторами или регуляторами. Эффекторы, снижающие активность ферментов, называются ингибиторами, повышающие активность – активаторами.
Механизмы изменения активности ферментов
1. Аллостерический. Регулятор действует на аллостерический центр.
Аллостерический центр – это участок фермента, пространственно не совпадающий с активным центром. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации фермента, а следовательно, и активного центра. Сродство фермента к субстрату при этом изменяется. Аллостерические регуляторы вызывают активацию или ингибирование фермента. Аллостерическими регуляторами являются метаболиты, макроэрги, коферменты, катионы металлов, цАМФ, субстраты.
2. Химическая или ковалентная модификация. Заключается в изменении химической структуры фермента путем присоединения или отщепления за счет ковалентных связей каких-либо химических групп в любом месте фермента. Химическое изменение фермента вызывает изменение конформации, а следовательно, активности. Химическая модификация может осуществляться путем:
- фосфорилирования - дефосфорилирования;
- метилирования - деметилирования;
- аденилирования – деаденилирования.
Частным случаем химической модификации является ограниченный протеолиз. Ограниченный протеолиз – это процесс отщепления какой-либо части фермента в виде олиго- или полипептида. В результате формируется активный центр.
4. Взаимодействие "белок-белок".Этот механизм регуляции характерен только для ферментов с четвертичной структурой, то есть состоящих из субъединиц. Диссоциация или ассоциация этих субъединиц приводит к изменению конформации активного центра. Для одних ферментов ассоциация приводит в активации фермента, а диссоциация – к ингибированию, для других - наоборот. Изменение взаимодействия между субъединицами возникает в результате присоединения аллостерического регулятора или в результате химической модифи-кации фермента.
Ингибирование
Ингибирование ферментов бывает обратимым и необратимым.
Необратимые ингибиторы прочно связываются с ферментами, при этом связываются или разрушаются функциональные группы, необходимые для проявления каталитической активности.
Необратимые ингибиторы не имеют физиологического значения и являются ферментными ядами.
Обратимыеингибиторы действуют недолго. Комплекс "фермент-ингибитор" непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом восстанавливается.
Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.
Конкурентный ингибитор похож на субстрат по структуре и форме, поэтому может конкурировать с ним за место в активном центре. Степень ингибирования зависит от концентрации субстрата и ингибитора.
Чем больше концентрация ингибитора, тем сильнее ингибирование.
Неконкурентныеингибиторы структурно не похожи на субстрат, поэтому действуют вне активного центра.