Определение числа гетеротрофных микроорганизмов методами посева.

Для выявления и учета гетеротрофных бактерий в воде и суспензии грунта использовали метод предельных разведений.

Отобранный грунт подвергали дополнительной обработке. 10 г грунта помещали во флакон с 90 мл стерильного раствора хлорида натрия, воздействовали ультразвуковой обработкой в течение 15 секунд. После ультразвуковой обработки пробу отстаивали в течение 5 минут (для осаждения крупных частиц грунта).

При использовании метода предельных разведений стерильный раствор хлорида натрия разливали в стерильные пробирки по 9 мл и на нем готовили ряд последовательных разведений. Пробы воды и исследуемую надосадочную жидкость грунта для приготовления разведений брали в количестве 1 мл. Для подсчета олиготрофных микроорганизмов использовали «голодный» агар, для учета эвтрофных – рыбопептонный агар (РПА); среды предварительно разливали в чашки Петри. Чашки с посевами инкубировали при температуре 20±0,5 °С.

После инкубации отмечали появление признаков роста: образование мути, пленки или осадка. Подсчитывались все выросшие колонии, видимые при увеличении в 2 раза. Подсчет производили только в тех чашках, в которых выросли изолированные колонии в количестве от 20 до 300. Подсчитанное число колоний на каждой чашке делили на объем пробы, засеянный в те чашки, в которых вели подсчет и вычисляли среднее арифметическое. Результат выражали в числе колоний в 1 см³ исследуемой пробы (Богданова, Макаревич, 2002).

Метод исследования соотношения бактерий различных морфологических групп гетеротрофных бактерий.

В воде исследовали состав гетеротрофных микроорганизмов, использовали метод предельных разведений (Перетрухина, Макаревич, Богданова, 2001).

При определении общего количество бактерий подсчитывали все выросшие на чашке колонии, видимые при увеличении в 2 раза. Результат выражали в числе колоний в 1 см³ исследуемой воды. При посеве 1 см³ неразбавленной пробы вели подсчет на чашках с любым количеством колоний, меньшим 300.

Соотношение количества бактерий разных форм определяли в фиксированных мазках, окрашенных по Граму. С чашки Петри со средами для роста гетеротрофных бактерий после инкубирования брали каждую колоние-единицу для приготовления фиксированного и окрашенного мазка. Подсчитывали количество мазков с явным превалированием палочковидных, кокковидных бактерий или микроорганизмов прочих форм, к которым относили микроскопические грибы, нитевидные, скользящие бактерии, спиралевидные и вибрионоподобные бактерии, а также бактерии неопределенной формы. Также подсчитывали количество мазков с явным превалированием грамположительных или грамотрицательных бактерий (Богданова, 2003).

Микрокопирование проводили с помощью биологического микроскопа БИОЛАМ с увеличением 90х с масляной иммерсией. При этом использовали сетчатый окуляр, один мазок просматривали в пятидесяти полях зрения. Далее вычисляли среднее арифметическое значение для количества встречаемости микроорганизмов одной формы, а затем определяли его долю в общем количестве учетных мазков.

Окраска по методу Грама

Грамотрицательные микроорганизмы образуют с генциановым кристаллическим или метиловым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, принимая розовый цвет.

1. Мазок, фиксированный на огне, окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем – раствором генцианового кристаллического фиолетового. Прокрашивание длится 1 – 2 мин.

2. Бумагу снимают, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1 – 2 мин до почернения препарата.

3. Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка необходимо погрузить несколько раз в стакан со спиртом.

4. Препарат тщательно промывают водопроводной водой.

5. Докрашивают спирто-водным раствором фуксина 2 мин.

Результаты окраски. Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.