Работа №3. Определение кетоновых тел в моче

Работа №1. Определение общего холестерина крови ферментативным методом

Принцип метода. Определение холестерина основано на использовании сопряженных ферментативных реакций, катализируемых холестеролэстеразой, осуществляющей гидролиз эфиров холестерина до свободного холестерина; холестеролоксидазой, осуществляющей превращение холестерина в холестенон с образованием Н₂О₂; пероксидазой, осуществляющей окисление перекисью 4-аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного продукта розово-малинового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации холестерина.

Реактивы:

А) Рабочий реагент - смесь лиофильно высушенных ферментов, буферного раствора, фенола, аминоантипирина

Б) Калибратор – калибровочный раствор холестерина 4,65 ммоль/л

Порядок выполнения работы:

1. По 1 мл рабочего реагента наливают в пробирку №1 (опыт) и

пробирку №2 (калибровочная проба), затем прогревают 5 минут при 37⁰ С

2. В пробирку №1 (опыт) добавляют 0,01 мл сыворотки крови,

в пробирку №2 (калибр. проба) - 0,01 мл калибратора

3. Пробирки выдерживают 20 минут в термостате при 37⁰ С

4. Измеряют оптическую плотность растворов на ФЭКе против Н₂О при длине

волны 490 нм в кювете 0,3 см

5. Расчет проводят по формуле: х = (А_опыт : А_калибр.) × 4,65 ммоль/л,

где А – оптическая плотность растворов (показания ФЭКа)

Уровень холестерина в норме (сыворотка) – 3,63 - 8,03 ммоль/л

Рекомендуемые пределы (желательные) для взрослых - < 5 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение. Гиперхолестеринемия – увеличение холестерина в крови, сопровождает гиперлипопротеинемии IIA, IIB, III типов; заболевания печени, холестаз, нефротический синдром, злокачественные опухоли поджелудочной железы и простаты, сахарный диабет и другие заболевания. Гиперхолестеринемия является фактором риска развития атеросклероза и одним их биохимических тестов патологии. Гипохолестеринемия наблюдается при болезнях печени (цирроз в поздней стадии заболевания, острая дистрофия печени), голодании, сепсисе, гиперфункции щитовидной железы и др.

Работа №2. Количественное определение липопротеинов низкой плотности

Szlig;-ЛП, ЛПНП) в сыворотке крови

Принцип метода:в основу метода положена способность ЛПНП осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора (гепарин способен образовывать с ЛПНП комплекс, который в присутствии хлорида кальция выпадает в осадок). По степени помутнения раствора и судят о концентрации ЛПНП в сыворотке крови.

Порядок выполнения работ:

В пробирку вносят 2 мл 0,27% раствора Cacl₂ и 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают.
Определяют оптическую плотность раствора (А₁) против Н₂О при длине волны 630 нм в кювете 0,5 см.
Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют 0,04 мл (2 капли) 1% раствора гепарина, перемешивают.
Ровно через 4 минуты снова определяют оптическую плотность раствора (А₂) в тех же условиях.
Расчет проводят по формуле: х = (А₂ – А₁)×100

В норме содержание ЛПНП (ß-ЛП) в сыворотке крови составляет 3 – 4,5 г/л (300-450 мг в 100 мл). Среднее содержание холестерина в ЛПНП составляет 40-50%

Клинико-диагностическое значение. Дислипопротеинемия – нарушение физиологического соотношения классов липопротеинов с повышением содержания определенного класса. Гиперлипопротеинемия – повышение концентрации в крови определенных классов липопротеинов, чаще всего - атерогенных (ЛПНП, ЛПОНП). Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, холестазе, острых гепатитах, диабете, ожирении и др.

Работа №3. Определение кетоновых тел в моче

Принцип метода: Ацетоуксусная кислота и ацетон в щелочной среде реагируют с нитрозогруппой нитропруссида натрия, образуя четырех валентные комплексные анионы вишнево-красной окраски. В работе используется индикаторные бумажные тест-полоски, пропитанные соответствующими реактивами, и приложенная к ним стандартная цветная шкала.

Порядок выполнения работ:

Конец индикаторной бумаги, пропитанной реактивами, опускают в исследуемую мочу, вынимают и кладут на стеклянную пластинку или чашку Петри.
Через 1-2 минуты сравнивают полученное окрашивание бумаги со стандартной цветной шкалой.

Интенсивность окрашивания зависит от количества кетоновых тел. Сопоставление полученной окраски с цветной шкалой позволяет сделать полуколичественное определение (+, ++, +++). Чувствительность тест полоски на ацетоуксусную кислоту (0,1 г/л) выше, чем на ацетон (0,4 г/л). В норме содержание кетоновых тел в моче минимальное (0,02-0,05 г/сут) и они не обнаруживаются применяемыми качественными пробами.нтенсивность окрашивания зависит от количества кетоновых тел. ндартной чветной шкалой четырех валентные комплексые анионы

Клинико-диагностическое значение. Кетоновые тела в значительных количествах (до 300-400 мг на 100 мл) появляются в крови в патологических случаях, например при сахарном диабете (кетонемия). Следствием этого является кетоацидоз и кетонурия – появление кетоновых тел в моче в количествах, определяемых тест-реакциями (10-50 г/сут). При сахарном диабете определение кетоновых тел в моче особенно важно не только для диагностики заболевания, но и для контроля эффективности лечения. Кетонемия и кетонурия может также наблюдаться при длительном голодании, неправильном пищевом режиме, в раннем детском возрасте и др.

Таблица 1. «Рекомендуемые уровни липидов крови»

Показатель	Оптимум
Холестерин общий (ммоль/л)	< 5
Коэффициент атерогенности	< 4
Холестерин ЛПНП (ммоль/л)	< 3
Триацилглицерины (ммоль/л)	< 2
Холестерин ЛПВП (ммоль/л)	> 1

Задание на самоподготовку:

Перечень контрольных вопросов:

1. Обмен и функции холестерина. Биосинтез холестерина в организме: последовательность реакций до образования мевалоновой кислоты, представления о дальнейших этапах, регуляция синтеза. Гиперхолестеринемия.

2. Транспортные липопротеины крови: особенности строения, состава, функций различных классов. Аполипопротеины. Липопротеинлипазы. Роль липопротеинов в обмене холестерина. Изменение концентрации липопротеинов и холестерина в крови, гиперлипопротеинемии, дислипопротеинемии.

3. Биохимия атеросклероза (гиперхолестеринемия, дислипопротеинемия, ПОЛ). Биохимические подходы к профилактике заболевания и его осложнений (ИБС, инфаркт миокарда, инсульт и др.)

4. Основные фосфолипиды тканей человека, их физиологическое значение. Представления о катаболизме фосфолипидов (роль фосфолипазы А₂, лизофосфолипиды). Биосинтез фосфолипидов, значение липотропных факторов. Жировая инфильтрация печени. Липоидозы.

Задания для самоконтроля:

Тестовый контроль знаний по теме:

1. Выберите один правильный ответ.

Жирные кислоты:

а) используются для глюконеогенеза при голодании

б) являются источниками энергии для мозга

в) являются источниками энергии в мышцах в первые минуты

интенсивной работы

г) окисляются в анаэробных условиях

д) в абсортивный период синтезируются в печени после приема пищи,

богатой углеводами

2. Выберите правильные ответы.

При депонировании жира:

а) повышается секреция инсулина

б) в крови увеличивается концентрация свободных жирных кислот

в) в крови увеличивается содержание ЛПОНП и хиломикронов

г) повышается активность триацилглицероллипазы

д)повышается активность ЛП-липазы

3. Выберите один правильный ответ.

Циклооксигеназа участвует в синтезе:

а) тромбоксанов из арахидоновой кислоты

б) лейкотриенов из арахидоновой кислоты

в) арахидоновой кислоты из линолевой

г) эйкозапентаеновой кислоты

д) простациклинов из тромбаксанов

4. Выберите один неправильный ответ.

Холестерол в организме:

а) является структурным компонентом мембран

б) используется как субстрат для синтеза кортизола

в) используется как субстрат для синтеза холевой кислоты

г) окисляется в организме до СО₂ и Н₂О

д) используется как субстрат для синтеза витамина Д₃

5. Выберите один неправильный ответ.

ГМГ-КоА-редуктаза:

а) находится в матриксе митохондрий

б) катализирует образование мевалоната

в) регулируется путем фосфорилирования-дефосфорилирования

г) является регуляторным ферментом синтеза холестерина

д) использует в качестве субстрата НАДФ

6. Выберите один правильный ответ.

Липопротеины, обеспечивающие удаление избытка холестерина из тканей:

а) ЛПОНП б) ЛПВП

в) Хиломикроны г) ЛПНП

7. Выберите правильные ответы.

Укажите причины, по которым ЛПВП называют «антиатерогенными»:

а) собирают избыток ХС с поверхности клеток периферических тканей

б) образуются из ЛПОНП

г) транспортируют холестерин в печень

д) постоянно циркулируют в крови

8. Выберите один неправильный ответ.

Причины гиперхолестеринемии:

а) дефект рецепторов ЛПНП

б) дефект ГМГ-КоА- редуктазы

в) избыточное потребление углеводов

г) снижение активности ЛХАТ

д) гликозилирование белков в составе ЛПНП

9. Выберите один неправильный ответ.

Для снижения концентрации холестерина в крови рекомендуется:

а) диета с повышенным содержанием крахмала

б) диета с повышенным содержанием клетчатки

в) диета с ограничением животных жиров

г) голодание

д) интенсивные физические нагрузки

10. Выберите правильные ответы.

Факторы, вызывающие жировую дегенерацию печени:

а) недостаток в пище холина и метионина

б) недостаток в пище жирорастворимых витаминов

в) накопление ТАГ в печени

г) кетогенез

д) стеаторея

Решить задачи:

Задача №1. При диспасеризации сотрудников «Дальзавода» проведено биохимическое исследование крови. У рабочего С., 40 лет, уровень холестерина составил 10 ммоль/л, ЛПНП – 6 ммоль/л. Дайте оценку полученным результатам.

Задача №2. При обследовании коллектива рабочих промышленного предприятия выявлено повышенное содержание ЛПНП в плазме крови у 25% обследованных мужчин в возрасте 20-40 лет. Каковы ваши заключения и рекомендации по коррекции этого состояния с биохимических позиций?

Задача №3. Воздействие различных токсических веществ может привести к развитию ожирения печени. Для профилактики патологии в условиях промышленного производства рабочие получают в качестве дополнительного питания молоко – ценный белковый продукт, богатый метионином. Объясните, почему метионин используется в качестве вещества, уменьшающего риск развития липоидоза печени?

Задача №4. Диета с пониженным содержанием углеводов и жиров является профилактикой атеросклероза и ожирения. Объясните влияние такого питания на концентрацию холестерина в крови.

Задача №5. Потребление жира рыб северных морей, богатых омега-3 ПНЖК, рекомендуется больным с гиперхолестеринемией и повышенным риском тромбообразования. Объясните, как изменится метаболизм холестерина и синтез эйкозаноидов при переходе на такую диету?

ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ УМЕНИЙ И НАВЫКОВ ПО ТЕМЕ

1.Приведите примеры заболеваний, патогенез которых можно объяснить нарушением обмена холестерина.

2.В составе, каких фракций липопротеинов крови, осуществляется транспорт холестерина?

3.Почему при атеросклерозе рекомендуется заменять животные жиры пищи растительными жирами?

4.Что такое кетоацидоз и каковы его последствия?

5.Из чего состоят желчные мицеллы и каково их значение в обмене холестерина в организме?

6.Перечислите условия, способствующие образованию желчных камней.

7.Перечислите липотропные факторы и пищевые продукты, богатые ими.

8.Каковы причины и следствия развития жировой инфильтрации печени?

9.Какие липиды обладают атерогенностью?

10.Каковы последствия инфильтрации сосудистой стенки ЛПНП?

11.Почему атеросклероз у мужчин встречается чаще, возникает раньше и протекает тяжелее?

Практическое занятие № 17

Тема: «Обмен и функции липидов»

(учебно-научно-практическая конференция)

Мотивация:Знание механизмов регуляции и биохимических параметров обмена липидов, понимание механизмов развития патологии липидного обмена необходимо для профилактики и коррекции этих состояний

Цель обучения, воспитания и развития:Закрепить знания о структуре и биологической роли липидов тканей и крови, рассмотреть механизмы регуляции липидного обмена в норме и его нарушениях при патологии с учетом современных достижений в липидологии.

Задачи, обучения, воспитания и развития:

Использование знаний раздела в медицинской практике:полученные по данной теме знания и умения формируют профессиональную базу, необходимую в последующем для изучения вопросов:

-кардиологии (патогенез атеросклероза и его осложнений)

-гастроэнтерологии (патогенез желчнокаменной болезни и др.)

-инфекционных болезней (патогенез гепатитов)

-диетологии (патогенез и профилактика ожирения и др.)

-педиатрии (патогенез наследственных заболеваний обмена липидов)

-патофизиологии (роль эйкозаноидов в развитии воспалительной реакции)

-фармации (введение лекарственных веществ в форме липосом)

-эндокринологии (нарушение метаболизма липидов при сахарном диабете и др.)

Этапы проведения занятия:

1. Вводная часть

2. Основная часть занятия: конференция

(доклады студентов по теме с последующим обсуждением)